氧自由基吸收能力测定方法的研究进展

基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（ＩＴＢＢ２Ｄ２００８－４－０７）作者简介：宋立霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，研究方向：植物抗氧化剂的高通量筛选。＊通讯作者

宋立霞１，２，王向社１，２，吴紫云２，３

，李明芳１，刘兴地１，郑学勤１，＊

（1.中国热带农业科学院生物技术研究所，海南海口571101；2.海南大学农学院，海南儋州571737；

3.中国热带农业科学院橡胶研究所，海南儋州571737）

氧自由基吸收能力测定方法的研究进展

ADVANCE IN OXYGEN RADICAL ABSORBANCE CAPACITY

SONG Li-xia 1,2,WANG Xiang-she 1,2,WU Zi-yun 2,3,LI Ming-fang 1,LIU Xing-di 1,ZHENG Xue-qin 1,*(1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,Hainan,China;2.College of Agriculture of Hainan University,Danzhou 571737,Hainan,China;3.Rubber Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Danzhou 571737,Hainan,China)Abstract:The principle,reactive mechanism,advantage and disadvantage of oxygen radical absorbance capaci －ty (ORAC)were revealed.The advance of ORAC at home and abroad was described.The significance of ORAC was explained.

Key words:oxygen radical absorbance capacity;antioxidant activity;antioxidant;free radical

摘

要：介绍氧自由基吸收能力（ORAC ）法的原理、反应机制及其优缺点，综述ORAC 法在国内外的研究进展，阐明

ORAC 法在抗氧化剂评价中的研究意义。

关键词：氧自由基吸收能力；抗氧化活性；抗氧化剂；自由基

盐也有显著的鲜味。

此外，氨基酸与戊糖或甲基戊糖的还原产物4-羧基戊烯醛作用生成含有氨基类的烯醛类的香味物质[6]。氨基酸种类不同，与戊糖作用所产生的香味风味也有差别。3.3其它菌群对泡菜风味的作用

主要是酵母类，如鲁氏酵母、圆酵母、隐球酵母等。酵母菌在缺氧条件下进行酒精发酵生成乙醇，乙醇本身具有香气，还能和有机酸结合成酯类，更能增加泡菜的香气。鲁氏酵母既有酒精发酵的作用，又能分解戊糖产生4-乙基-愈创木酚[7]

，

对泡菜的风味有辅助性作用。此外，少量的醋酸菌在泡菜发酵的后期阶段也起一定的作用，产生的醋酸具有风味的同时，还能与醇类结合生成酯类，增加泡菜的香气香味。4结论

泡菜是一种营养卫生的蔬菜发酵制品，泡菜风味取决于发酵所用的蔬菜原料和发酵所用的乳酸菌种和

其他相关菌种。深入了解泡菜发酵的风味形成原理，有利于进一步改善泡菜制品的风味，有利于加速泡菜工业的产业化进程，同时可为调香师提供重要依据。参考文献:

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收稿日期：2008-05-22

222222222222222222222222222222222222222222222222

众所周知，许多慢性与退化性疾病如癌症、心脏病、神经元退化疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer)及帕金森氏症(Parkinson）等均被认为是因为过氧化物质或含自由基物质在人体内引起的一连串反应，造成身体组成物质如蛋白质、脂质及DNA受到伤害，这也是引起老化的主要原因。摄食水果、蔬菜与坚果类食品可获取抗氧化所需的矿物质及维生素，如硒(selenium)、V C (ascorbic acid)、V E(tocopherols)及其异构体生育三烯醇(tocotrienols)等，是抗氧化物的极佳来源[1]。

1抗氧化剂与自由基的关系

器官的正常活动或氧化压力过剩，体内可产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive ni－trogen species,RNS)等自由基，当体内自由基超出一定量后就会出现失衡（或称氧应激，oxidative stress）现象，从而引起一系列的生物学反应，导致癌症、心脏病和衰老等疾病的发生。研究表明，抗氧化剂能够有效地清除自由基，从而可以阻断或预防疾病的产生。

抗氧化剂(antioxidant)是指在比可氧化底物（糖类、脂质、DNA或蛋白质）浓度更低的情况下，能有效地延缓或阻止底物发生氧化反应的物质。目前，抗氧化剂已被广泛用于食品、医药、美容等领域。按照作用机理的不同，抗氧化剂主要分为两类：一类称作链断裂型抗氧化剂(chain-breaking antioxidants)，另一类称作阻止型抗氧化剂(pre－ventative antioxidants)。前者通过清除自由基而中断或延缓链反应的进行，如V C、V E、多酚、β-胡萝卜素等；后者主要是通过阻止自由基的形成，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)等[2]。

2抗氧化剂抗氧化能力的评价方法

随着对生物抗氧化剂和天然抗氧化剂的不断深入研究，对抗氧化剂的测定评价方法也在不断发展完善。按照作用机理的不同，目前常用方法主要有两类：一类基于单电子转移途径(single electron transfer,SET)，例如FRAP(ferric reducing/antioxidant power)法和TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)法，抗氧化剂被氧化，单个电子从抗氧化剂分子转移到氧化剂分子上，用紫外可见分光光度计来测定抗氧化剂或者氧化剂的吸光值，以吸光值的变化来评价抗氧化剂清除自由基的能力；另一类基于氢原子转移途径(hydrogen atom transfer,HAT)，例如ORAC(oxygen radical absorbance capacity)法和TRAP(total radical absorption potentials)法，抗氧化剂和底物竞争含氮化合物产生的过氧自由基，过氧自由基从抗氧化剂获得一个氢原子，结果过氧自由基和底物的反应被延迟或者被阻止。ORAC法即氧自由基吸收能力（又称为抗氧化能力指数），作为国际抗氧化能力测定的新标准，越来越受到人们的重视，是目前抗氧化研究领域中人们最关注的评价方法之一，ORAC值越高，抗氧化能力就越强[3]。

3ORAC法的原理

该法以V E水溶性类似物6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧基(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic,Trolox)为定量标准，根据自由基破坏荧光探针使荧光强度产生变化的原理，以荧光素钠盐(fluo－rescein disodium)为荧光物质，在485nm光激发下，可发射527nm荧光。2,2'-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐[2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH]在水溶液中通过释放过氧自由基，将荧光素钠盐氧化，荧光强度变化的大小反映自由基破坏的程度。当抗氧化剂存在时，可与荧光素钠盐竞争氧化剂，抑制由自由基引起的荧光变化，减缓其荧光衰退的速度，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力。试验中利用全自动液体分装系统加样，并将样品稀释为不同的浓度梯度，样品和标准抗氧化物(Trolox)分别与荧光素溶液混合后37°C保温，然后再加入AAPH溶液，迅速开始测定，利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度(initial fluorescence intensity)值记为f0，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f0、f1、f2…，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的保护面积(net area under the curve,net AUC)（图1）。抗氧化剂的O－RAC值是通过其荧光衰退曲线的net AUC与标准抗氧化物质Trolox的net AUC相比得出的（图2）。ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g(μmol TE/g)、μmol Trolox equivalent/mg(μmol TE/mg)、μmol Trolox e －quivalent/mL(μmol TE/mL)表达[4-5]。

图1抗氧化剂的保护面积[3]

Fig.1The net area under the curve(AUC)[3]

4ORAC法的研究进展

4.1ORAC法的反应机制

ORAC法是近年来由Cao[6-8]等在Glazer[9]的研究基础上发展起来的。最早是用从Porphyridium cruentum 中分离的β-藻红蛋白（β-phycoerythrin,β-PE）作为荧光探针的，通过β-PE的荧光衰退曲线反映出它与过氧自由基反应对荧光的破坏程度。后来，Ou等[5]研究发现β-PE存在一些缺陷：(1)从Porphyridium cruentum中分离得到的蛋白β-PE，具有很大的可变性，纯度不高且成本较高；（2）β-PE的荧光具有不稳定性，暴露在激发波长下会快速自发衰退，使其难以定量计算；（3）β-PE可与多酚类抗氧化剂非特异性结合，甚至在没有自由基产生的情况下使荧光特性消失，从而干扰了测定结果。

为了解决这些问题，Ou等[5]选用葡萄籽提取物(grape seed extracts,GSE)在不加AAPH的情况下分别与β-PE和荧光素(3',6'-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1 [3H],9'[9H]-xanthen]-3-one,FL)反应，结果表明β-PE 可以与GSE非特异性结合，而FL与GSE没有交互作用。通过对葡萄汁、红茶等不同样品的ORAC

β-PE

值和ORAC FL值的比较，发现各种样品的ORAC FL值明显高

于ORAC

β-PE

值。FL是一种人工合成的非蛋白质探针，它克服了β-PE所存在的一些缺陷，与过氧自由基的反应具有特异性。因此，用FL取代β-PE，使得ORAC 方法得到了快速的发展和广泛的应用。起初，ORAC法仅限于测定水溶性链断裂型抗氧化剂对过氧自由基的清除能力，而忽略了脂溶性抗氧化剂对脂质氧化的抑制作用。为了扩大ORAC方法的应用范围，Huang等在50%的丙酮水溶液中加入7%的RM-β-环糊精(ran－domly methylatedβ-cyclodextrin)起到增溶效果，因此，改进的ORAC方法可以有效地测定亲脂性和亲水性抗氧化剂对过氧自由基的清除能力[10]。

ORAC反应是一个经典的氢原子转移(HAT)的氧化过程。在试验条件下，一分子的AAPH失去一分子氮

气，生成两分子AAPH自由基(方程1)。在空气中，生成的AAPH自由基很快与O

2

反应(方程2;K

4

=109/mol·s)生成相对稳定的过氧自由基ROO·。荧光素的荧光衰退曲线表明过氧自由基对荧光素的破坏程度。在没有抗氧化剂存在的情况下，ROO·从FL获得一个氢原子(方程3)，致使荧光素的荧光衰退；在有抗氧化剂(ArOH)存在的情况下，ROO·从抗氧化剂获得一个氢原子，生成ROOH和一个稳定的抗氧化剂自由基ArO·(方程4)，致使荧光素被过氧自由基破坏的速率受到抑制[3]。Ou等指出ORAC试验条件下，荧光衰减速度和荧光素的浓度没有关系，而与AAPH的浓度有关。因此，整个过程的反

应速度受方程1反应的限制（k

3

=3.19×10-7/mol·s），大多数样品不会影响AAPH的分解速率，AAPH本身也不影响样品。所以，ORAC方法可以直接测定链裂解型抗氧化剂清除ROO·自由基的能力[2，5]。

R－N＝N－R→2R·+N2(1)

R·+O2→ROO·(2)

ROO·+probe(fluorescent)→ROOH+oxidized probe (loss of fluorescence)(3) ROO·+ArOH→ArO·+ROOH（4）4.2ORAC法在抗氧化能力检测方面的应用

ORAC法自1993年问世以来[6]，经过10余年不断发展和完善，得到了快速的发展和广泛的应用。最近几年，国内外已广泛采用ORAC法对植物、食品提取物、生物制品以及纯化合物等多类样品的抗氧化能力进行分析研究。

4.2.1ORAC法在植物提取物中的应用

Cao等[8]于1996年采用ORAC法测定了22种蔬菜，一种绿茶和一种红茶清除自由基的能力，结果发现蔬菜清除ROO·的能力以蒜头最强，最强与最弱之间差异可达20多倍，清除OH·的能力以羽衣甘蓝最强，其中绿茶和红茶清除ROO·的能力比所有的蔬菜都高；Wang等[11]于1997年利用ORAC法对12种水果和5种市售果汁进行了抗氧化活性测定，其中草莓的ORAC值最高，其次是李子和橘子，果汁中葡萄汁的ORAC值最高，其次是柚汁和番茄汁；Guo等[12]于1997年采用高效液相色谱-电化学（库仑电极）阵列检测技术对水果和蔬菜的电活性化合物进行检测，并证明样品的ORAC值与电化学值具有明显的相关性；Wang等[13]于2000年对不同生长期黑莓(blackberry)、悬钩子(rasp－berry)和草莓(strawberry)的果实和叶片进行了抗氧化活性研究，其中黑莓和草莓在未成熟期的ORAC值最

图2ORAC值的计算公式[3]

Fig.2Calculation of ORAC values[3]

注：AUC=1+f1/f0+f2/f0+f3/f0+f4/f0+…+f n/f0。

ORAC=[(AUC samle-AUC blank）/(AUC Trolox-AUC blank）×（molarity of Trolox/mo－larity of sample）

高，而红色悬钩子在成熟期的ORAC值最高，叶片越老ORAC值越低；2002年，Ou等[2]用ORAC法和FRAP 法分别对13种蔬菜，927份样品进行了抗氧化能力测定。结果按ORAC绝对平均值对13种蔬菜抗氧化活性进行排序为：青椒>菠菜>紫洋葱>椰菜>甜菜>花椰菜>辣椒>白洋葱>食荚菜豆>西红柿>菜心>胡萝卜>豌豆；Wada等[14]对5种caneberries进行抗氧化能力测定，结果黑色悬钩子(black raspberries)的ORAC值最高(453μmol TE/g)；Kurilich等[15]对8种椰菜的亲水性提取物和亲脂性提取物分别进行了ORAC值比较，结果亲水性提取物的ORAC值范围为65.8μmol TE/g~ 121.6μmol TE/g，亲脂性提取物的ORAC值范围为3.9μmol TE/g～17.5μmol TE/g；Ou等[16]提出氧化和抗氧化作用的阴阳学说，并对25种中药材进行了ORAC分析，其中有12种阴性中药材的平均抗氧化能力约是另外13种阳性中药材平均抗氧化能力的6倍。

4.2.2ORAC法在食品提取物中的应用

Gheldof等[17]于2002年对不同植物源的蜂蜜进行了总酚含量测定及ORAC分析，结果表明酚类化合物是引起蜂蜜抗氧化活性的主要因素；Wu等[18]对美国市场上常见的100种食品分别进行了亲水性和亲脂性ORAC测定，包括水果、蔬菜、坚果、果干、香辛料、谷类食品、婴儿食品等，结果亲水性提取物的ORAC值(L-ORAC)范围为0.87μmol TE/g～2641μmol TE/g，亲脂性提取物的ORAC值(H-ORAC)范围为0.07μmol TE/g～1611μmol TE/g，大部分食品的L-ORAC均小于H-O－RAC的10%；Miller等[19]于2006年采用ORAC法对美国市场上比较畅销的6种可可粉和巧克力食品进行了抗氧化能力测定，结果表明纯天然可可粉的抗氧化活性最高，其次是可可浆；2008年，Szydlowska-Czerniak 等[20]采用ORAC法对油菜籽油和橄榄油的抗氧化活性进行了研究，结果表明油菜籽油的抗氧化活性高于橄榄油的抗氧化活性。

4.2.3ORAC法在生物样品中的应用

脂质的过氧化反应可能与动脉硬化的发病机理有关，研究表明维生素能够阻止脂质的过氧化反应[21]，Huang等[22]于2002年通过对机体分别补充V C和V E，并对其血清进行ORAC法分析，结果表明V C和V E对机体中脂质过氧化反应均有影响；2003年，Prior等[23]用ORAC法分别对来源于两组人血浆中的亲水性和亲脂性抗氧化剂进行活性测定，一组是6位不抽烟的健康女性（60岁~70岁），她们血浆中亲脂性抗氧化能力占总抗氧化能力的（33.1±1.5）%，第2组是10位不抽烟的健康青年女性（22岁~24岁），她们血浆中亲脂性抗氧化能力占总抗氧化能力的（28.2±1.9）%，ORAC法为血浆或浆液中亲脂性抗氧化剂的测定提供了有效的途径。

4.2.4ORAC法在纯化合物中的应用

近年来对作为多酚的花青素(anthocyanin)对健康可能带来的好处的关注越来越集中，花青素是一种天然色素，广泛存在于花、果实以及一些蔬菜中，Wang等[24]于1997年用ORAC法测定了包含飞燕草素(delphinidin)、矢车菊素(cyanindin)、天竺葵素(pelargonidin)等14种花青素的抗氧化活性，其中矢车菊素葡萄糖苷(kuro－manin,cyanidin-3-glucoside)的ORAC值最高，是Trolox的3倍，天竺葵素的ORAC值最低，但仍然和Trolox相当；Prior等[25]于1998年分析测定了越橘属的4种植物成熟果实的ORAC值与总花青素含量的关系，结果表明总花青素的含量与样品的ORAC值具有一定的相关性(r xy＝0.77)。可见花青素是一种强有力的抗氧化剂，这种特性在功能食品和保健食品中有可能得到广泛的应用。此外，白藜芦醇(resveratrol)是一种酚类化合物，已发现有强大的抗氧化活性。植物产生白藜芦醇，以保护自己免受恶劣的生长条件和天气的影响。白藜芦醇已被证明，可以减少氧化的低密度脂蛋白胆固醇，总胆固醇及心血管疾病的风险[26]。

5ORAC法的优缺点

ORAC方法的优越性：ORAC方法可以提供稳定可控的自由基，这些自由基与食品和生命现象中的自由基具有高度的一致性，并且可以通过改变自由基和反应体系的溶剂测定脂溶性和水溶性物质的抗氧化活性；ORAC测定的抗氧化剂对氧自由基引起的氧化反应的抑制是经典的单纯依靠氢转移反应使自由基链式反应终止的，反应机制明确；使用了曲线下面积(AUC)的方法，将抗氧化剂对自由基作用的抑制时间和抑制程度结合成一个单独的量，与在特定时间测量抑制百分率或者在特定抑制百分率处测定抑制时间的其它抗氧化测定方法比具有相对的优越性；多通道液体处理系统和微孔板分析仪的使用大大缩短了ORAC方法测定时间，同时也克服了不同样品或相同样品的不同浓度由于加样时间等造成的误差，从而实现了ORAC测定的自动化和高通量化[3]。

当然，ORAC方法中也存在一些不足：一方面，ORAC方法对温度非常敏感，整个微孔板控制相同的温度是最基本的，不同孔温度的变化都可能影响试验的重现性，由于AAPH自发分解产生过氧自由基的速率主要取决于温度，因此在加入AAPH前37°C保温

20min可以减小试验误差；另外，FL的荧光强度对反应体系的pH值相对敏感，当pH低于7.0时，其荧光强度显著降低，但实验证实即便以纯醋酸为样品进行分析时，反应体系的pH值仅从7.40降低到7.35，说明缓冲溶液体系可以充分消除样品pH值对FL荧光强度的影响；ORAC方法并不是总抗氧化活性的测定方法，因为它只是测量清除过氧化氢自由基的能力，生物学相关的氧自由基还包括HOO·，HO·，ONOO·和O2·-等[5,10]。

6ORAC法的研究意义

我国是食品的生产与消费大国，随着人民生活质量的提高，对食品的营养和质量提出了更高的要求；同时我国又拥有丰富的天然资源，大力开发特有天然抗氧化剂，可使资源优势尽快转化为经济优势。ORAC法作为目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为简单、准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一，适合抗氧化活性的高通量筛选，更有利于消费者的需求和天然抗氧化剂产业本身的发展。

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收稿日期：2008-06-10