微生物的制片染色技术

微生物的制片染色技术

微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均

需经特殊方法染色后，才能进行观察。

细菌的制片染色

细菌涂片的制作与简单染色

涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。

简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。此方法用于观察细菌外形及大小。

革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。

染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。

革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。

特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。

芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。菌体红色，芽孢绿色。

用结晶紫等染液对芽孢菌简单染色，也可看到芽孢，此时染料使未形成芽孢的菌体着色，芽孢壁亦稍着色，芽孢内部为一未着色的空圈，若芽孢已脱离菌体，可形成一四周着色的空圈，在显微镜下清晰可见。

荚膜染色：荚膜对染料的亲和力较差，不易着色。用简单染色法可使菌体着色，荚膜呈浅色或无色，镜检时可见，但不易与背景区分。若经简单染色后（石碳酸复红染1分钟，水洗，风干），在载片的一侧加墨汁1滴，再用吸水纸条吸引，使墨汁经涂菌面引向另一侧，风干后镜检，菌体红色，背景黑色，菌体周围不着色的一圈即荚膜。

荚膜染色用培养24～48小时的产荚膜菌种（常用圆褐固氮菌）。因荚膜较薄且易变形或脱落，故制片时要轻轻涂抹，不加热，自然风干固定，以免荚膜变形。

鞭毛染色：细菌的鞭毛直径仅0.02～0.03微米，经特殊方法染色处理后，可在光学显微镜下观察。染色方法各有不同，但主要原理都是用不稳定的胶体溶液为媒染剂，使其沉淀在鞭毛上，经染色后，鞭毛加粗。

鞭毛染色所用菌种需在新制备的斜面培养基上培养16～20小时。如菌种长期未用，需在新鲜培养基上连续移种2～3次，使其活化。

染色步骤：

（1）在培养好的菌种斜面管中，沿管壁加入0.5～1毫升无菌水，放37℃温箱中静置半小时，制成菌悬液。用滴管自表面取菌液，滴在干净的载玻片上，每片1滴，可连续滴数片。轻轻晃动玻片，使菌液散开成片（不可涂布，以免鞭毛脱落），平放风干。

（2）滴加甲液，静置3～5分钟，用蒸馏水轻轻冲洗，将甲液充分洗去，再用乙液冲去残水，加乙液数滴，在酒精灯上微温，使产生蒸气但勿干涸，经30～60秒，用蒸馏水轻轻冲去乙液。擦去背面及周围水渍，风干。甲、乙液见鞭毛染色剂。

镜检可见菌体褐色，鞭毛浅褐色。应多找几个视野，因往往只在部分视野能见到已着色的具鞭毛的菌体。注意：鞭毛染色所用玻片必须十分清洁，毫无油渍；操作过程各步均需认真仔细。

细菌运动的观察生有鞭毛的细菌，可在水中自由运动（快速前进、摆动或滚动），用适当方法，可在高倍镜下观察细菌（纯菌种，或牙垢，污水）的运动。最简便的方法即压滴法：取十分清洁的盖片及载片，在载片中央滴上菌液，将盖片一侧接触菌液缓缓放下，使其稍悬浮但无气泡，轻轻放在载物台上，将视野调暗，先用低倍镜，再用高倍镜观察，小而透明的菌体常呈淡绿色的小亮点或细小的杆状，运动迅速。

观察细菌运动的关键是载片和盖片必须十分清洁，毫无油渍。若使用有鞭毛菌的

纯菌种，应按鞭毛染色的菌种要求进行活化和培养。用高倍镜观察时必须十分仔细，以免污染或损坏镜头。

常用细菌染色剂的配制细菌的菌体多带负电荷，易和带正电荷的碱性染料结合而着色。常用的结晶紫、复红、美蓝、孔雀绿等，均为碱性染料。

普通染色用的染色剂配制方法：

石碳酸复红：碱性复红（basic fuchsin）0.5克，溶于95％酒精10毫升；石碳酸5克，溶于蒸馏水95毫升，两液混合，摇匀，用滤纸过滤。用时稀释5～10倍，保存原液。

吕氏美蓝：美蓝酒精饱和液（美蓝（methylene blue）5克溶于95％酒精）30毫升；0.01％KOH水溶液100毫升，二液混合，过滤。

革兰氏染色剂：

结晶紫（crystal violet）染液：

甲液：结晶紫2克，95％乙醇20毫升。

乙液：草酸铵0.8克，蒸馏水80毫升。

结晶紫与酒精混匀，搅拌至溶解；草酸铵溶于蒸馏水中，二液混合，摇匀，静置48小时后使用。此液置棕色瓶中可保存数月。亦常用于简单染色。

卢戈（Lugol）氏碘液：碘片（I2）1克，碘化钾（KI）2克，蒸馏水300毫升。先用少量蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，溶解后，加入余下的蒸馏水，置棕色瓶中。可保存数月。

0.5％番红：番红O（safraninO，藏红O）0.5克，溶于95％酒精20毫升，再加蒸馏水80毫升。

芽孢染色剂：

孔雀绿染液：孔雀绿（malachita green）5克，加少量蒸馏水搅拌溶解，稀释至100毫升，静置半小时，过滤后保存。

0.5％番红。

鞭毛染色剂：

甲液：丹宁酸5克，三氯化铁（FeCl3）1.5克，福尔马林（15％）2毫升，1％氢氧化钠（NaOH）1毫升，蒸馏水100毫升。用蒸馏水溶解丹宁酸、三氯化铁，再加入福尔马林、氢氧化钠。

乙液：硝酸银（AgNO3）2克，蒸馏水100毫升，搅拌至溶解，取出10毫升备用；向其余90毫升硝酸银中滴加浓氨水（NH4OH），即形成浓厚的沉淀，继续加至沉淀刚刚消失，成为澄清溶液。向此澄清液中缓缓滴入备用的硝酸银液，可出现薄雾，轻轻摇动，直至薄雾经摇后不消失为止。注意切勿过量！

鞭毛染液配制过程必须严格操作，配成的染液应当天使用，过夜一般无效。

放线菌的制片方法放线菌的菌丝纤细，宽度近似杆状细菌；营养菌丝与基质结合紧密，不易观察。为了在显微镜下观察放线菌的完整形态，可用玻璃纸法培养。具体方法是：

1.按无菌操作要求，在无菌培养皿中倒入培养基，待凝固后，放上一块灭过菌的玻璃纸（将剪成近于培养皿大小的玻璃纸夹在两层白纸中，放培养皿中灭菌后，取出备用），使其在培养基上展平并紧贴在培养基上。

在玻璃纸上接种0.1～0.2毫升放线菌孢子悬液，涂均匀，盖好后，将平皿倒置于25～28℃温箱中培养5～7天，待玻璃纸上长出白色绒毛状菌丝后，取出培养皿。

2.在一块干净载片上滴一滴水，从长菌的玻璃纸边缘剪下一小块，以其下面接触水面并展平，使无气泡，用吸水纸吸去多余的水。注意勿使生长放线菌的玻璃纸面上沾水，以免污染镜头和影响清晰度。观察时，不加盖片，在低倍镜下找到成团的菌丝体，再换高倍镜观察。首先看到孢子丝、气生菌丝，再向下轻调细螺旋，可看到平展分枝的基质菌丝。

用此方法也可观察青霉、曲霉等霉菌，但接种孢子量应比放线菌少，所用培养基、培养时间和温度均按霉菌要求。

霉菌的制片方法霉菌的菌丝比放线菌粗，宽度平均3～10微米，在低倍镜下即可观察。其菌丝也分为气生菌丝和基质菌丝。为观察自然生长的霉菌整体形态，也需要与培养方法结合。除采用上述玻璃纸法培养观察外，还可采用载片培养法。具体方法如下：

1.在无菌培养皿中放入折叠成4～5层的长方形无菌滤纸，加入3～5毫升冷开水，使滤纸浸湿，但不淹没。取一干净载片，用酒精沾湿，在酒精灯火焰上灼烧灭菌。稍凉后，放入培养皿中，置滤纸上。

2.用无菌吸管吸取少量熔化的马铃薯琼脂培养基，半开皿盖并使培养皿稍倾斜，迅速将培养基滴散在载片上，使在中央成一薄层（厚度不超过1毫米）。

3.用接种环沾取少量霉菌孢子，接种在已凝固的培养基上，注意使孢子散开。盖

好皿盖，放25～28℃温箱中培养3～5天，待长出白色菌丝及浅色的孢子时，取出载片，擦干背面及四周的水渍，置低倍镜下，调节焦距，可清晰看到向上生长的繁殖菌丝和平面生长的营养菌丝。此种载片培养，若保持平皿内的湿度，置低温下可保存1～2周。

酵母菌的制片方法酵母菌细胞较大，宽1～5微米，在自然界常见于含糖较多的果实、蔬菜表面及土壤中，用适当方法培养后，在低倍镜下即可观察其细胞及出芽生殖。

1.配制2％的糖水（葡萄糖、蔗糖均可），放入干净的瓶中，加稀盐酸至pH3～4，接入几块成熟的葡萄皮或苹果皮（不要洗），瓶口加棉塞或纱布。置25～28℃温箱培养1～2天，待培养液中出现混浊或沉淀后即可取出。亦可用市售鲜酵母培养。

2.用吸管自瓶底吸取少量培养液，滴在干净载片上，自液滴一侧轻轻盖上盖片，注意勿使产生气泡，用吸水纸吸去多余水分，即可观察。若在盖片一侧滴1滴稀释美蓝染液，用滤纸在盖片另一侧吸水，使美蓝进入盖片下与菌液混合，在显微镜下观察，可见到酵母菌的死细胞染成蓝色，活细胞无色或浅黄绿色。