细胞的破碎--3

微生物的代谢产物既有的分泌到细胞之外，也有存在于
细胞内部 植物细胞产物多为胞内物质。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄 清的滤液，作为进一步纯化的出发原液
对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎，使
代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。
第一节 细胞的结构与组成
主要由肽聚糖、 氨基酸、 糖、脂质等化学成分组成。 破碎细菌的主要阻力 来自于肽聚糖的网状结构， 其中肽键的数量和交联程 度是主要影响因子。
2 真菌的细胞壁
真菌细胞壁较厚，约 100~250nm ，主要由多糖
组成，其次含有少量的蛋白
质和脂类。

与酵母和细菌一样，真
菌细胞壁的强度及聚合物网
状结构有关，另外与其含有
（1）细胞的处理量（不同方法）
（2）细胞壁的强度和结构（不同方法试剂）。
（3）目标产物对破碎条件的敏感性。
（4）破碎程度。
第三节
破碎方法的选择
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核 酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质 量的减少，因此需要： 加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；
图 4. 8
超声波震荡器
细胞悬浮液入口
冷却水出口
槽式超声波粉碎机
细胞悬浮液出口
冷却水入口
探头超声波粉碎机
4、 超声波法—影响因子
声强和振幅影响很大，但二者强度不宜过高，否则 会使活性物质（如：蛋白质）受到破坏。 菌体的种类和浓度、离子强度、pH值对超声波法处 理效果影响也较大。 频率的变化对超声波法处理效果影响不明显。
1、 酶解法--其他酶解法
（2）抑制细胞壁合成：某些抗生素如：青霉 素或环丝氨酸，能阻止新细胞壁物质的合成。 抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期 加入。只有当抑制剂加入后，生物合成和再生 还在继续进行，溶胞的条件才是有利的。这样 在细胞分裂阶段存在的细胞壁有缺陷，故能达 到溶胞作用。
2、 化学法溶胞
图4.5 高压匀浆机
DY89-I型 电动 玻璃匀浆机
高压匀浆机结构剖析图
高压细胞匀浆机
2、 撞击法（即X-挤压器法）

原理：将浓缩的菌体悬浮液冷却至零下 25℃～零下30℃形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压 阀小孔中挤出。由于冰晶体受压磨损， 包埋在冰中的微生物产生变形而引起细 胞破碎。
一级反应速度过程，符合下列公式： ln［l／（l一R）］＝Kt
其中： K— 一级反应速度常数；
t—时间； R—破碎率。 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，
3、 珠磨法—高速珠磨机
影响因子： （1）珠体的直径：珠体的大小应根据细胞大小和浓 度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来 而确定。
的几丁质和纤维素的结构有 关。
二、 植物细胞壁的组成与结构
初生壁:
a 多糖 : 纤维素, 半纤 维素和果胶
b 蛋白质 次生壁: (部分植物细胞有 次生生长而产生)

破碎植物细胞的阻力 主要决定于细胞壁的初生 壁的厚度及次生壁的有无 与厚度。
第二节 细胞破碎技术
目前有多种细胞破碎的方法，以适应不同类型的 细胞壁的破碎，可归纳为两大类：机械法和非机 械法。
触面积，
同时，超声波产生的振动作用加强了胞内有效成
分的释放，提高目标物从固相转移到液相的传质
速率。
4、 超声波法—基本结构
超声波震荡器由发生器和换能器组成，发生器能
产生高频电流，换能器则是把电磁震荡转换成机 械振动。 超声波震荡器可分为槽式和探头直接插入介质两 种形式。后者的破碎效果比前者好。
讨论课准备
一、讨论课准备 讨论题目：生物细胞破碎方法及发展动态 全班分成8-9个组，以小组为单位分工合作，自行查寻资料并 做成PPT。
在4.22日，即第9周上课时间进行汇报讲解，每组可派1-2名 代表进行讲解，每组汇报的时间控制在15min之内；讲解完 毕后，由底下每组排出的一名代表对其内容、表达进行评分， 最后所得分数为各个评分的平均分。
第四节 破碎技术研究的方向与破碎率确定
一、破碎率确定
1.直接计数
（1）计数器 （2）平板计数 （3）显微镜
2.间接计数
（1） 活性测定 （2） 电导率测定
思考题
1. 细胞破碎的意义？
2. 细胞破碎的主要方法有哪些，相应机理？ 3.超声波破碎的工作原理和应用与注意事项？ 4. 酶解法溶解细胞壁的机理是什么？ 5. 如何测定细胞破碎程度？
（2）珠体装量：影响破碎程度和所需能量，珠体量 的增加使热扩散性能降低而引起温度升高。
（3）搅拌速度：增加搅拌速度能提高破碎效率，但 过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大， 所以搅拌转速应适当。
4、 超声波法
原理： 超声波是在溶剂和样品之间产生声波空穴作用， 导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而 使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接
4、 超声波法—应用
破碎动植物组织、病毒、细菌和其它细胞结构， 被广泛应用在生化、医药、食品检测、环保监测
等领域。是应用较多的一种破碎方法。通常采用
的超声波破碎机在15到25千赫（kHz）的频率下
操作。
适于实验室规模细胞破碎。 注：超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作 时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷 却剂进行冷却。
加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶
的活性， 加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力， 还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适 合于目的物质的提取。
第四节 破碎技术研究的方向与破碎率确定
一、破碎技术研究的方向 1. 多种破碎方法相结合: （机械与非机械法，化学法与冻-融法） 2. 与上游过程相结合（改变细胞培养条件） 3.与其他后续操作相结合 （破碎与萃取）。
切力层之间的碰撞和磨料的滚动而导致细胞的
破碎。
应用：工业规模的破碎中，可以采用高速珠
磨机，适用于大量微生物细胞破碎。
图4.7 高速珠磨机
料液出口 料液进口
冷却剂进口
磨 室 冷 却 剂 出 口
磨 室 冷 却 剂 入 口
冷 却 剂 出 口
WSK卧式高效全能珠磨机
3、 珠磨法—高速珠磨机
机理：高速珠磨机破碎作用是相对于时间的
后步分离
缺点：酶水解价格高，故小规模实验应用广泛。
1、 酶解法--其他酶解法
其他酶解法：
（1）自溶作用：利用生物体自身产生的酶来 溶胞，而不需外加其他的酶。
改变微生物的环境，可以诱发产生过剩的 酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 影响因素：温度、时间、pH缓冲液浓度、 细胞代谢途径等。

应用：可用于某些对所含生化物质冷冻不敏
感的细胞的破碎，或释放某些细胞组分。
3、 物理渗透法--干燥法

机理：用各种干燥法使细胞膜渗透性改变，当用 丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就 容易被抽提出来

分类：干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾 干燥和冷冻干燥等。
第三节
选择依据：
破碎方法的选择
机械法
研磨法 珠磨破碎法
便宜 便宜
超声波法
用超声波的空穴， 适中 扰动作用使细胞破 碎
昂贵
1、 高压匀浆法
原理：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀， 然后突然减压使细胞高速冲击撞击环造成细 胞破裂。 应用：高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用 方法。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母 菌等难破碎或浓度高或处于生长静止期的细 胞，常采用多次循环的操作方法。
（3）增溶法
是利用表面活性剂的增溶法。 最典型的是将体积为细胞体积两倍的某浓度的表 面活性剂加入到细胞中。表面活性剂能将细胞壁 破碎，制成的悬浮液可用离心分离除去细胞碎片， 再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。
2、 化学法溶胞
特点： 对产物的释出选择性好 细胞外形较完整、碎片少，便于后步分离 该法引入的这些试剂容易引起生化物质破坏 还会带来分离和回收化学物质的问题。
原理：
压挤
撞击 剪切 化学渗透 物理渗透
图4.1 压挤
压挤/撞击作用
压挤作用
图4.2 剪切
剪切作用
图4.3
化学渗透
化学渗透作用
图4.4 产物释放
破碎细胞中保内产物释 放过程
一、
机械法
概念：主要是利用高压、研磨或超声波 等手段在细胞壁上产生剪切力或挤压达 到破碎细胞的目的。 主要方法：高压匀浆法、撞击法、珠磨 法和超声波法。
机理：通过各种化学试剂对细胞壁的作用,溶解 细胞或抽提细胞内组分。 （1）酸碱处理法 ：酸能使蛋白质水解成氨基 酸；碱和表面活性剂能溶解细胞壁上的脂类， 使胞内组分渗出 （2）有机溶剂法：一些脂溶性有机溶剂如： 氯仿、丙酮、丁醇、丁酯等，能溶解细胞壁上 的磷脂层，使细胞结构破碎。
2、 化学法溶胞
该项分数占总分的10%。 汇报完毕后，各组将PPT打印并交上来（采用每页6张PPT页 面的形式打印）。
课程论文
一、题目：翻译一篇有关某种生物分离技术的研 究现状与进展的外文文章 二、要求： 1、翻译后中文字数至少1500字 2、参照一般论文的基本格式来写（包题目、作者 与班级学号、摘要、关键词、正文、参考文献）
常见各种机械法比较
方法 技术 匀浆法（片型） 撞击法（孔型） 原理 效果 成本 适中 适中 举例 动物组织及动 物细胞 细胞悬浮液大 规模处理 研磨法 细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理 细胞悬浮液小 规模处理
细胞被搅拌器劈碎 适中 须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被研磨设备磨 适中 碎 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎