第三章细胞破碎
生物工业下游技术选择题复习要点
第二章发酵液预处理一、选择题1、在发酵液中常加入B，以除去发酵液中的钙离子。
A. 硫酸B. 草酸C. 盐酸D. 硝酸2、在发酵液中加入草酸，其作用是ABCD。
A. 去除钙离子B. 去除部分镁离子C. 改善发酵液的过滤性能D. 有助于目标产物转入液相。
3、在发酵液中加入三聚磷酸钠，它和B形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。
A. Ca2+B. Mg2+C.Zn2+D. Fe3+4、环丝氨酸的发酵液中，加入磷酸盐的主要目的是去除AD。
A. Ca2+B. Fe3+C. Zn2+D. Mg2+5、在发酵液中加入黄血盐，可去除C，使其形成普鲁士蓝沉淀。
A. Ca2+B. Zn2+C. Fe3+D. Mg2+6、关于阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力，以下说法正确的是ABCD。
A. Al3+＞Fe3+B. H+＞Ca2+＞Mg2+C. K+＞Na+＞Li+D. Fe3+＞H+＞K+7、酵母絮凝的FLO1型只被以下A抑制。
A. 甘露糖B. 葡萄糖C. 麦芽糖D. 蔗糖E. 半乳糖8、酵母絮凝的NEW FLO型只被以下E抑制。
A. 甘露糖B. 葡萄糖C. 麦芽糖D. 蔗糖E. 半乳糖9、发酵液中，细胞絮凝机理有A。
A. 胶体理论B. 高聚物架桥理论C. 双电层理论D. 盐析理论10、在生物产品分离中，C技术可代替或改善离心和过滤方法，富集或除去发酵液中的细胞或细胞碎片。
A. 凝聚B. 双水相萃取C. 絮凝D. 色谱11、下列物质属于絮凝剂的有AC 。
A、明矾B、石灰C、聚丙烯酸类D、硫酸亚铁第三章细胞破碎技术一、选择题1、高压匀浆法提高细胞破碎率的方法有ABC 。
A. 适当地增加压力B. 增加通过匀浆器的次数C. 适当地增加温度D. 提高搅拌器的转速2、下列AB 可采用高压匀浆法进行细胞破碎。
A. 大多数细菌B. 酵母C. 放线菌和霉菌D. 含有亚细胞器（如包涵体）的微生物细胞3、珠磨法提高细胞破碎率的方法有BCD 。
生化分离工程_苏海佳_第三章细胞破碎
5. 胞内产物的选择性释放
细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部 释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离 纯化带来困难。
1、目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物 质尽量少释放，粗分。
生化集成：利用两种以上的不同阶段的分离过 程同时进行。
2、原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种 酶的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先 释放，细胞内部或细胞器内后释放。
本章要点
珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法 和超声波法破碎细胞的基本原理和 应用条件？ 胞内产物的选择性释放的原理？
生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热 爱。21.1.1921.1.19Tuesday, January 19, 2021 人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。04:49:2704:49:2704:491/19/2021 4:49:27 AM 做一枚螺丝钉，那里需要那里上。21.1.1904:49:2704:49Jan-2119-J an-21 日复一日的努力只为成就美好的明天 。04:49:2704:49:2704:49Tues day, January 19, 2021 安全放在第一位，防微杜渐。21.1.1921.1.1904:49:2704:49:27Januar y 19, 2021 加强自身建设，增强个人的休养。2021年1月 19日上 午4时49分21.1.1921.1.19 精益求精，追求卓越，因为相信而伟 大。2021年1月 19日星 期二上 午4时49分27秒04:49:2721.1.19 让自己更加强大，更加专业，这才能 让自己 更好。2021年1月上午 4时49分21.1.1904:49Januar y 19, 2021 这些年的努力就为了得到相应的回报 。2021年1月19日星期 二4时49分27秒04:49:2719 January 2021 科学，你是国力的灵魂；同时又是社 会发展 的标志 。上午4时49分 27秒上 午4时49分04:49:2721.1.19 每天都是美好的一天，新的一天开启 。21.1.1921.1.1904:4904:49:2704:49:27Jan- 21 相信命运，让自己成长，慢慢的长大 。2021年1月19日星期 二4时49分27秒Tues day, January 19, 2021 爱情，亲情，友情，让人无法割舍。21.1.192021年1月19日 星期二 4时49分27秒21.1.19
工艺学3-细胞破碎
第三章
第一节 第二节 第三节
（二）高速珠磨机 （High speed bead mill）
第三章
第一节 第二节 第三节
高速珠磨机工作原理
磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园 盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离 小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层 之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
（二）、目的物的稳定性 （三）、破碎效果和产物释放率
第三章
第一节 第Байду номын сангаас节 第三节
方法 匀浆法
机 械 珠磨法 法
超声波
表 3-1 常用的细胞破碎方法
原理
特点
基于液相的剪切力
适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广 泛应用，但不适用于某些高度分支的微生物，另 外产热大，可能造成生物活性物质失活
利用研磨作用破碎
胞 内 冰 晶 引 起 细 胞 膨 较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅
胀破裂
适于在实验室中使用
渗透压冲击法 渗透压突然变化，使细 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 胞快速膨胀破裂
化学试剂处理 应 用 化 学 试 剂 溶 解 细 需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，
胞 或 抽 提 某 些 细 胞 组 可应用于大规模生产
第三章
第一节 第二节 第三节
三、化学法（Chemical treatment）
（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂
（二）酶解法（Enzymatic lysis） （三）制成丙酮粉
第三章
第一节 第二节 第三节
四、选择破碎方法的依据
（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨
细胞破碎PPT课件
高压匀浆器
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:
压力 (工业生产中常用55～70MPa的压力) 循环操作次数(多次循环的操作方法)
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
细胞破碎的方法（按细胞所受作用）
分类
作用机理
适应性
高压匀浆法 液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌
珠磨法
固体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难
物 超声破碎法 理 破 渗透压法 碎
革兰氏阴 性细菌的 外膜
壁膜间隙
革兰氏阴性细菌的细胞壁
O-特异多糖 (O-polysaccharide)
核心多糖(corepolysaccharide)
蛋白质
孔蛋白 类脂A (Lipid A)
(脂多糖)
脂蛋白
磷脂分子
细胞壁的结构和特点
微生物 壁厚/nm
革兰氏阳 革兰氏阴 性细菌 性细菌
20-80
反复冻融法
液体剪切作用
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
破碎率较低，常与其他方法结合使用
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
干燥法
改变细胞膜的渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
X-press法 固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合
第三章生物材料预处理
第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离第一节预处理及固液分离一、预处理的依据1、生物活性物资存在方式与特点胞内胞外成分复杂含量不一2、后续操作要求如果后续操作有离子交换法，对无机离子等要求高。
3、目的物的稳定性有效成分的生理活性不断变化较稳定物可以用剧烈的变形处理除杂二、动物材料的预处理绞肉机冻融高压匀浆器三、发酵液(培养液)的预处理预处理的目的? 改变发酵液(培养液)的物理性质，以利于固液分离。
主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。
? 去除发酵液(培养液)中部分杂质以利于后续各步操作。
预处理的方法（一）、加热加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液(培养液)加热到所需温度并保温适当时间。
加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液(培养液)的粘度，使固液分离变得容易。
但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。
预处理的方法（二）、凝聚和絮凝凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞(分泌胞外产物)、细胞的(分泌胞内产物)碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。
其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液(或培养液)，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。
1.凝聚凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。
凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷(如细胞或菌体一般带负电荷)，因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。
常用的无机盐类凝聚剂有：Al2(SO4)3?18H2O(明矾)、AlCl3?6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等;常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。
2.絮凝絮凝是指使用絮凝剂(通常是天然或合成的大分子量聚电解质)，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
细胞破碎课件PPT
酶解法是一种利用酶来分解细胞壁的方法，通常使用溶菌酶、蜗牛酶等酶类物质。
酶解法的优点在于对细胞壁的破坏作用较小，能够保持细胞内物质的完整性，适用 于提取细胞内活性物质。
酶解法的缺点在于酶的种类和浓度对破碎效果影响较大，且酶解过程较慢，需要较 长时间才能达到理想的破碎效果。
溶菌酶破碎
溶菌酶是一种专门作用于细菌 细胞壁的酶，能够破坏细菌细 胞壁，使细胞壁水解而破碎。
高压破碎
原理
常用设备
利用高压作用使细胞膜破裂，释放细胞内 的物质。
高压均质机、高压破碎机等。
应用范围
注意事项
适用于各种类型的细胞，尤其是对细胞壁 有破坏作用的高压破碎。
高压破碎需要严格控制压力和作用时间， 以避免对细胞内物质造成过度破坏。同时 ，需要确保设备的安全性和稳定性。
04
生物法破碎细胞
酶解法
溶菌酶破碎适用于革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌的破碎，尤 其对革兰氏阳性菌的破碎效果 较好。
溶菌酶破碎的优点在于破碎效 率较高，且对细胞内物质的破 坏作用较小。
蜗牛酶破碎
蜗牛酶是一种天然的酶，能够分解细 胞壁和细胞膜，使细胞内的物质释放 出来。
蜗牛酶破碎的优点在于能够有效地释 放细胞内的物质，且对细胞内物质的 破坏作用较小。
免疫学研究
细胞破碎后提取的细胞成分可以用于免疫学研究，如抗原-抗体反应、 细胞因子检测等，有助于深入了解免疫系统的功能和调控机制。
在药物制备中的应用
1 2
天然药物提取
许多天然药物来源于动植物细胞，通过破碎细胞 可以提取有效成分，如中药材的有效成分。
合成药物的合成与改造
在药物合成中，细胞破碎可用于释放细胞内的酶 或其他生物催化剂，以促进药物的合成或改造。
第三章 细胞破碎解读
有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
变性剂
盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲素（Urea） 是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而 使疏水性化合物溶于水溶液。
化学渗透法优点：
（5）化学渗透法 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地 渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结 构与组成。
表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双 分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。
原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞 环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力作用下破碎。
压力：50~70MPa 速度：450m/s
高压匀浆器针型阀结构简图
高压匀浆器各种阀型设计
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难 破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环 的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程， 被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方 程可表示为：
EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结
构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维
持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将 脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂 来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
第三章 细胞破碎
3.5.2 与上游相结合
（3）克隆噬菌体溶解基因 ：在细胞内引进噬菌体基 因，培养结束后，控制一定条件（如温度等）， 激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出 内含物。 （4）耐高温产品的基因表达 ：如果产品能表达成 耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在 较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷 却费用，又简化了分离步骤。
酶溶法的特点（外加酶）：
（1）酶溶法需要特定的反应条件。 （2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和 化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应 的次序。 （3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件 温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 （4）酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法 通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存 在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有 抑制作用。
3.3.1 珠磨法
细胞破碎率可用一级反应动力学表示 ： 间歇操作： ln[1/(1-R)]=Kt 连续操作： ln[1/(1-R)]=Kτ 其中 τ =V/F
式中： R—破碎率（g/g） K—反应速率常数(1/s) t—破碎时间(s) τ —平均停留时间(s) V—破碎室悬浮液体积（L） F—进料速率(L/s)
《生物分离工程》 Bioseparation Engineering 第三章 细胞破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 ) 路线一 路线二 清液－胞外产物
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d2 V = —1—8μ(ρs—ρ) ω2 r
四、细胞碎片悬浮液的固液分离
3. 双水相萃取
• 定义—利用物质在互不相溶的两水相分配系数的差异
进行分离纯化的过程
五、破碎率及其测定方法
1. 破碎率（R）=C / Cm ( %, mg/g )
结构—多层三维网状结构 革兰氏阴性和阳性的差别（厚度、紧密度、是否有外膜）
一、 细2、霉菌类 胞 组 成 — 几 丁 质 （ N- 乙 酰 葡 聚 糖 胺 的 聚 合 壁 物）、葡聚糖、蛋白质、脂类等 的 结构—四层三维网状结构 组 成3、酵母菌类 和 组成—甘露聚醇、葡聚糖、蛋白质、脂类 结等 构 结构—三层三维网状结构
• ln [R / (1-R)] = K t
2. 测定方法
• 直接测定法 • 目的产物测定法 • 导电率测定法
思考题
1、细菌细胞壁与真菌（酵母）细胞壁在组成上有何
区别？ 2、细胞破碎主要有那几种方法？ 3、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特
点？ 4、何谓脂溶破碎法？其原理是什么？包括那几种？ 5、酶法细胞破碎常用那几种酶类？
第三章 细胞破碎方法
一、细胞壁的组成和结构
1. 细菌类
组成—肽聚糖（多糖、氨基酸）、脂类
肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由N-乙酰胞壁酸(NAM)、N-乙酰葡 萄糖胺(NAG)和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β-1.4 糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上， 肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽 “尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构
三、机械法与非机械法破碎的比较
项目
机理 内含物释放 碎片大小
粘度
设备 应用范围
机械法
切碎细胞 全部 细小 高
专用 工业化、实验
非机械法
溶解局部壁膜 部分（有选择）
较大 低
无 实验研究
四、细胞碎片悬浮液的固液分离
1. 膜分离——微滤、超滤等
2. 高速离心
• 密度梯度离心—在高速离心场作用下，样品中各组
二、细胞破碎方法
1、细胞破碎方法分类
1) 机械破碎法（高压匀浆法、高速珠磨法、超声波 法等 ）
2) 非机械破碎法（化学法、酶解法、渗透压法、冻 融法、干燥法等 ）
2、机械破碎法
2.1 高压匀浆法
1) 定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪 切力而达到细胞破碎的过程
2) 工作原理：液－液剪切力、压力差等 3) 特点：
2) 工作原理：空穴现象 3) 特点：
❖ 适用对象一般 ❖ 仅实验室中应用 ❖ 细胞完全破碎 ❖ 需冷却，噪音
3、非机械破碎法
3.1 化学（脂溶）法
1) 定 义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，
使内含物有选择性地释放出来的过程
2) 原 理：
酸碱 有机溶剂 表面活性剂 螯合剂
3.2 酶解法
适用对象广 工业化、实验室中应用 细胞完全破碎
2.2 高速珠磨法
1) 定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力 而达到细胞破
3) 特点：
适用对象较广 工业化、实验室中应用 细胞完全破碎 需冷却
2.3 超声波法
1) 定义—利用超频率声波（15-25kHz）在液体 介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎 的过程
1) 定义—利用酶促反应分解细胞壁上的键而达到 细胞破碎的过程
2) 原理
外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、 β –1,6）、 葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤 维素酶、脂酶等
内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液 浓度、激活剂等
3.3 渗透压法 3.4 冻融法 3.5 干燥法