第四章 细胞破碎..

层次
单层
主要 肽聚糖(40组成 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
革兰氏 阴性细菌
酵母菌
霉 真菌
10-13 nm
100-300nm
100250nm
多层
多层
多层
肽聚糖 (5-10%) 葡聚糖(30-
多聚糖
脂蛋白
40%)
(80-90%)
脂多糖(11-
甘露聚糖(30%) 脂类
22%)
蛋白质(6-8%) 蛋白质
用超声波的空穴作 适中 用使细胞破碎
须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎
细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
昂贵 适中 便宜
细胞悬浮液小 规模处理
细胞悬浮液大 规模处理
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
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※ 2 CHEMICAL METHODS 化学方法
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n 表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法， 表面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶 消化法和碱处理法。
缺点： ➢溶酶价格高， ➢溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) ➢产物抑制的存在。
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碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而 且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种 反应，包括使磷脂皂化。
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碱处理法
碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组 分从细胞内渗漏出来。
成本低，反应激烈，不具选择性。
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n 阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷 基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和 三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常 是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。
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n 非离子表面活性剂是溶于水的聚合物。经济价值不明确， 市场上用于做洗碗剂。同样，这种清洁剂既有亲水基团 又有疏水基团。亲水基团不是硫酸盐，不是烷基胺盐而 是乙醇。
第四章 细胞破碎
1
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。
2
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是 在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
=-RTc1+ … 该式称为范特苛夫定律。
(4.3-3)
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n 由该方程知细胞内压力必须小于细胞外压力，否者， 水会流入细胞内，溶破细胞。我们可以采用等式4.23 估算出渗透压的大小。许多细胞内溶质浓度大约为 0.1M NaCl 或0.2M溶质 。
n 由此可见渗透压必须很大，才导致了细胞的破碎。
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它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。
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植物次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4μm以上)，常有三层组成。 n 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增 加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则， 而且存在木质素的沉积。
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n 由于肥皂的增溶作用依赖于羧基，因此只有在 PH 值较高，羧基解离的情况下，肥皂才是有效 的表面活性剂。在硬水中，由于Ca2+与羧酸基 团形成不可溶的沉淀，而使肥皂失效。
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n 可通过将肥皂的羧基用硫酸盐代替来改变传统肥皂的缺 点。硫酸盐代替的肥皂是目前洗衣店常用及超市中常见 的表面活性剂。硫酸盐可连在苯环上，结构如图4.2-1 所示。这种硫酸盐表面活性剂比碱对细胞破碎的作用更 好，磺酸盐不易被微生物降解，所以洗衣店中并不常用。
温和 温和 适中 剧烈
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
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表 4.0-1. 细胞机械破碎法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
机械法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中
研磨法
细胞被研磨物磨碎 适中 便宜
动物组织及动 物细胞
超声波法 匀浆法（孔型） 珠磨破碎法
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酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法， 但是也都有各自的缺点。
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1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细
胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破
坏细胞膜。
溶菌酶、
1）外加酶法
β-1，3-葡聚糖酶、
β-1，6-葡聚糖酶、
常用的溶酶 蛋白酶、
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1）渗透压冲击法
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，
将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀 释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然 变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而 破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理 或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使 细胞壁有缺陷，强度减弱。
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n 这类表面活性剂起作用在于能溶解细胞壁中的脂，进行 细胞破碎。图4.3-2表示了该表面活性增溶的原理。在 高度稀释洗涤剂中，脂会溶解在溶液中；超过这个浓度 溶解的物质的量与浓度成正比。还有，表面活性剂的表 面张力是常数，表面活性的选择电极可以突然改变。
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3）.有机溶剂
能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物 质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等
化学渗透法特点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子
优点 量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等
大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液 分离和进一步提取。
缺点
通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%.
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2） 、 增溶法 第二种是利用表面活性剂的增溶法。最典型的是将体积 为细胞体积两倍的某浓度的表面活性剂加入到细胞中。 表面活性剂能将细胞壁破碎，制成的悬浮液可用离心分 离除去细胞碎片，再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。
放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖 为主要成分，所以也能采用溶菌酶，
酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、 几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。
植物细胞壁的主要成分是纤维，常采用纤维素酶和
半纤维素酶裂解。
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酶解法的特点
优点：
发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整
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无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型， 都是两性的，既能和水作用也能和脂作用， 能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通 透性增加或溶解 细胞破碎常用的表面活性剂：
十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏 内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。
9
红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物
最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混 合物，
第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图 10
细胞壁的组成和结构
微生 物
壁厚
革兰氏 阳性细菌
20-80 nm
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渗透流的动力来自渗透压，渗透压可能很大。可以通过 化学平衡来估算，水的化学电势是常数，即：
µH20 (outside) = µH20 (inside)
(4.3-1)
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细胞外纯水的化学电势包括标准化学电势和压力修正项；与之平 衡的胞内的化学电势包括三项，即标准化学电势、压力修正相 和浓度修正项。对于理想的不可压缩溶液，这些修正相和式 （4.2-1）可改写为：
3
概述
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破 坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产 物成分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌 型生化物质（产品）的基础。
为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了 解各种微生物细胞壁的组成和结构。
4
1 细胞壁结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。
通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。
不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
5
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链；
相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
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n 方法有效在于表面活性剂的化学性质，化学性质由图 4.3-1所示的化学结构表示。结构中有一个亲水基团， 通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。
n 表面活性剂通常是两性的，既能和水作用也能和脂作 用。
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n 无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是 两性的。SDS（十二烷基磺酸钠）是典型的阴离子表面 活性剂。阴离子表面活性剂还包括肥皂（脂肪酸盐）。
甘露糖酶、
糖苷酶、
肽键内切酶、
壳多糖酶等
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外加酶法
有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加 入时需确定相应的次序。
对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作 用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入 葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生 质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。