微生物细胞破碎原理和技术
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
细菌反复冻融破碎方法-概述说明以及解释
细菌反复冻融破碎方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细菌反复冻融破碎方法是一种常用的实验技术，用于破碎细菌细胞以释放其内部物质。
该方法通过将细菌悬浮液在低温条件下冷冻，并在适当时机进行快速融化，重复多次冻融循环，使细菌细胞膜失去完整性，从而实现有效破碎。
这种方法已被广泛应用于生物学、微生物学和分子生物学等领域的研究中。
细菌冻融破碎方法的关键在于冷冻和融化的过程。
在冷冻过程中，细菌细胞受到低温的刺激，使得细胞内的水分分子形成冰晶，从而引起细胞膨胀和压力增加。
而在融化过程中，细胞内的冰晶破裂，导致细胞膜的破碎。
通过多次反复冻融循环，可以增加细菌细胞膜的破碎率，从而获得更高的细胞内物质释放效率。
细菌冻融破碎方法具有多种优点。
首先，这种方法简单易行，不需要复杂的设备和试剂，适用于各种细菌样品。
其次，通过冻融循环，可以有效破碎细菌细胞，释放细胞内的物质，如蛋白质、DNA和RNA等，为后续的研究提供了可靠的样品。
此外，细菌冻融破碎方法还可以有效地保存细菌样品，避免了细菌的死亡和变质。
然而，细菌冻融破碎方法也存在一些局限性。
首先，该方法对细菌样品的处理过程需要严格控制，过程中的温度、时间和次数等因素都会对破碎效果产生影响，需要经验丰富的操作者进行操作。
其次，在某些情况下，由于细菌的尺寸较小或细菌细胞膜较厚，冻融方法可能无法完全破碎细胞膜，从而影响后续的实验结果。
因此，在具体应用中需要针对不同的细菌样品进行优化和调整。
总之，细菌反复冻融破碎方法是一种简单有效的实验技术，通过冷冻和融化的过程破碎细菌细胞，释放细胞内的物质。
该方法在生物学、微生物学和分子生物学等领域的研究中有着广泛应用，并且具有多种优点。
然而，在具体应用中还需根据不同的细菌样品进行优化和调整，以确保实验结果的准确性和可靠性。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照以下结构进行探讨细菌反复冻融破碎方法的要点：2.1 细菌冻融破碎方法要点1在本节中，我们将介绍细菌冻融破碎方法的第一个关键要点。
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
生化分离技术 第二章 细胞的破碎
第二节 细胞壁的破碎
破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一. 在用球磨法破碎细胞的过程中,影响因素有以下几个方 面: (1)搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加,剪切力增大, 细胞破碎量增大,但是高的能量消耗,高的热量产生和磨球 的磨损以及因剪切力引起产物失活,因此对于给定处理量和 对蛋白质的释放要求下,存在着最佳效率点.实际生产中, 搅拌器外缘速率控制在(5～15)m/s之间.
1 x = exp(kt )
式中 x——为释放蛋白质的分率; k——为蛋白质释放常数,min-1; t——为超声波发射时间,min.
(2-5)
蛋白质释放常数k取决于输入声能,由实验确定.对于 从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液),用190声瓦的 20HZ声频的超声波处理时: k=b(P-P0)0.9 (2-6)
第二节 细胞壁的破碎
式中 b——为常数; P——为输入功率,J/(kg.s); P0——为由超声波引起的空穴的临界功率,J/(kg.s). 当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量,当产生的气 泡破裂时,绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收, 为避免高温,在破碎池中设计了冷却水夹套,并在开始时先 把悬浮液冷却至0℃～5℃,并不断将冷却液连续通过夹套, 短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作,以防止高温使 蛋白质变性. 为提高破碎效率,在破碎池中可添加细小的球粒(可以 是钢制的或玻璃的),以产生"研磨"效应,提高细胞破碎 率. 超声波破碎是实验室常用的一种普通方法,由于向大量 的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难,因此在工业还未 采用.
第二节 细胞壁的破碎
Y % = [ ( N 0 N ) N 0 ] ×100%
式中 N0——原始细胞数量; N——经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数 量. N0和N可由直接计数法和间接法求得. 直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计 数法进行计数. 间接计数法是在细胞破碎后,将悬浮液离心分离,除去细 胞碎片,未破碎的细胞及其他悬浮物,然后对清液进行蛋白质 含量或酶的活性进行分析.通过细胞释放出来的化合物的量R 与所有细胞理论最大释放量Rm的比值R/Rm,求出破碎率. (2-3)
微生物细胞的破碎
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
浅谈常用细胞破碎方法
浅谈常用细胞破碎方法随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。
现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下：关键词：细胞破碎机械法酶法（一）细胞破碎的定义1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
2.破碎各种细胞的主要阻力：2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度;2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度;2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。
(二) 细胞破碎的方法1.机械法1.1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器（High pressure homogenizer）操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
操作方式：单次或多次循环出口温度：20℃左右压力：55－70Mpa适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。
料液细胞浓度：20%左右。
☆团状和丝状菌，不宜使用。
注意事项：（1）操作温度：↑２－３℃/10MPa（2）对料液作冷却处理。
（3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。
（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合该法处理【1】。
1.2珠磨机研磨珠磨机研磨：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
工作原理：细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起，磨室配有冷却夹套。
注意事项：操作参数较多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30%左右。
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该法对冷冰－融解敏感的生化物质不适用。
（4）超声波法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一
个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡 在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞 内液体发生流动，从而使细胞破碎。
对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，
2、非机械法
非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、 干燥法和化学法溶胞等。
（1） 酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达 到破壁的目的。
外加酶法 常用的溶酶
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溶菌酶、溶菌酶主要用于细菌类 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等
酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
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另一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷 却至－25℃至－30℃形成冰晶体，利用500MPa以上 的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞 破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的 变形所引起的。此法称为X－press法，主要用于实验 室中。
该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片 的粉碎程度低以及活性的保留率高。
一、细胞壁的组成和结构 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构
微生物 革兰氏阳性细 菌
壁厚/nm
20-80
层次
单层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
革兰氏阴性细 菌
10-13
多层
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
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（2）高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法。
利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压 和高速冲击撞击环造成细胞破裂。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循 环的操作方法。
（3）X－press法
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分 子的α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞 移至低渗溶液中使细胞破裂。
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利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学 组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖 结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后 只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂， 释出胞内产物。
法
低，通用性差
渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用
冻结融化法 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物
干燥法 改变细胞膜渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
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细胞破碎机理图
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1、机械方法 为了粉碎微生物细胞，常常选择机械的方法，因
杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳 性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。
超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以
在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行 冷却。
该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高 的能量来提供必要的冷却，这是困难的。
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为它们的处理量大，破碎速度较快。采用这些方法， 细胞受到由高压产生的高剪切力，但在大多数情况 下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产 生的过多热量，防止生化物质破坏。
（1）珠磨机
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研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃
小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到 细胞的某种程度破碎。
酵母菌
霉菌
100-300 100-250
多层
多层
葡聚糖 多聚糖 （30-40%） （80-90%） 甘露聚糖 脂类 （30%） 蛋白质 蛋白质 （6-8%） 脂类
（8.513.5%）
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细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构， 网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细 菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联 的紧密程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状 结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
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为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共 价键。各种微生物的细胞壁的结构和组成差异很大， 壁结构不仅取决于遗传信息，也取决于生长的环境， 真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变化。
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和革兰氏阳性菌
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
Hale Waihona Puke 溶酶价格高，通用性差械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结 构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化 学方法的依据。
二、微生物细胞的破碎技术 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
＝＝＝＝基本说出
分
类 作用机理
适应性
机 珠磨法
械 法 高压匀浆法
固体剪切作用 液体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
高速组织捣碎机和Braun匀浆器是实验室规模的细 胞破碎设备，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而达到破 碎的目的。
这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速 升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。
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在工业规模的破碎中，可以采用高速珠磨机。在 这种设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液 和玻璃珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间 的碰撞和磨料的滚动而引起的。