第四章 细胞破碎技术
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第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
第四章 细胞破碎..
层次
单层
主要 肽聚糖(40组成 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
革兰氏 阴性细菌
酵母菌
霉 真菌
10-13 nm
100-300nm
100250nm
多层
多层
多层
肽聚糖 (5-10%) 葡聚糖(30-
多聚糖
脂蛋白
40%)
(80-90%)
脂多糖(11-
甘露聚糖(30%) 脂类
22%)
蛋白质(6-8%) 蛋白质
用超声波的空穴作 适中 用使细胞破碎
须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎
细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
昂贵 适中 便宜
细胞悬浮液小 规模处理
细胞悬浮液大 规模处理
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
15
※ 2 CHEMICAL METHODS 化学方法
16
n 表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法， 表面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶 消化法和碱处理法。
缺点： ➢溶酶价格高， ➢溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) ➢产物抑制的存在。
22
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而 且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种 反应，包括使磷脂皂化。
23
碱处理法
碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组 分从细胞内渗漏出来。
成本低，反应激烈，不具选择性。
38
n 阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷 基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和 三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常 是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。
chapter4细胞破碎
适中
适中 适中
适中
便宜 昂贵
动物组织及动 物细胞
细胞悬浮液小 规模处理
匀浆法 （孔型）
珠磨破碎 法
须使细胞通过的 小孔，使细胞受 到剪切力而破碎
细胞被玻璃珠或 铁珠捣碎
剧烈
适中
细胞悬浮液大 规模处理
剧烈
便宜
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
1.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
破碎细胞的目的就是破坏细胞壁和细胞膜，增加其通透性， 尽可能释放胞内的目标产物。
细胞破碎多用于小规模生产，在大规模生产中应用极少。
4.1 细胞壁
细胞壁：细胞膜强度差，易破碎，细胞壁坚韧，是主要的破碎 阻力，植物细胞和微生物细胞具有细胞壁，破碎难度大，动物 细胞没有细胞壁，破碎难度小。 不同微生物细胞壁具有不同的特性
度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高；很难破碎
植物细胞：具有初生壁，次生壁；次生壁的形的机械强度，很难破
碎。
4.2 化学破碎法
表 4.0-1. 细胞化学破碎法
方法 化学法 技术 渗透冲击 原理 渗透压破坏细胞 效果 温和 成本 便宜 举例 血红细胞的 破坏
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、
Braun匀浆器；
中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国 西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。
珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式表示：
4. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利 用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小 孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋 在冰中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不 适应于对冷冻敏感的生化物质。
细胞破碎技术
细胞破碎技术
细胞破碎技术是一种将细胞壁破坏并使细胞内部成分释放出来的方法。
这种技术常用于提取和分离细胞内的蛋白质、DNA、RNA等分子。
常见的细胞破碎技术包括机械破碎、超声破碎、冻融破碎和化学破碎等方法。
1. 机械破碎：使用研钵、高速搅拌器、螺旋刀等机械设备对细胞进行破碎，通过物理力使细胞破裂，并释放出细胞内的分子。
2. 超声破碎：利用高频率的超声波对细胞进行振荡，产生剧烈的机械剪切力和微小气泡的崩溃，从而破碎细胞壁。
3. 冻融破碎：将细胞冷冻后迅速加热，重复冻结和加热的过程会使细胞壁破裂，并释放出细胞内的成分。
4. 化学破碎：利用化学试剂对细胞进行处理，如使用碱性溶液、表面活性剂或酶，以破坏细胞壁，使细胞破碎并释放出细胞内的分子。
细胞破碎技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域，可用于提取纯化目标分子、研究细胞内的代谢过程、检测疾病标志物等。
第4章细胞破碎2010
第四章 微生物细胞破碎
第一节 第二节 第三节
细胞破碎的分类 细胞壁的组成与结构 常用破碎方法 珠磨法 高压匀浆法 超声波破碎法 酶解法 化学渗透法 其它方法
第四节 破碎率的测定与破碎技术的研究方向
第一节 细胞破碎的分类
许多生物产品都存在于细胞内部（如胰岛素、干扰素）
很多基因工程产物都是胞内物质， 因此，细胞破碎是提 取这些成分的第一步，也是提取产物的关键性步骤，
关于破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生物工程学者 的关注。
二、细胞破碎的分类
细胞破碎的目的是释放出细胞内含物， 其方法很多，按照是否施加外力可分为 机械法和非机械法两大类。
机械法工业运用较为成熟，非机械 法的实验室研发也相当活跃。
机械法中的高速湿法珠磨和高压匀浆
法不仅在实验室被广泛运用，而且已经在工 业生产中应用。非机械法中的酶溶法和化学 渗透研究也较为成熟。新型破碎手段，如激 光破碎法、冷冻-喷射法、高速相向流撞击法 等的研究有待进一步深入和完善。
四、细胞壁结构与细胞破碎
细胞破碎就是破坏细胞壁网状结构的共价键，对于不 同的细胞，由于其细胞壁的组成及结构的差异，破碎的难 以程度不同。
对于机械破碎，细胞的大小和形状、细胞壁的厚度及 聚合物的交联程度，影响破碎的难以程度。个体小、球形、 厚壁、交联程度高的细胞难破碎。
对于酶法或化学溶剂法，细胞壁的组成特别重要，结 构次之。
高压匀浆一般需多级操作，每次循环前进行级 间冷却。提高压力有利于细胞破碎，但会增加能耗。
存在的问题 除了较易造成堵塞的团状或丝状 真菌以及较小的革兰氏阳性菌不适合此法外，其他 微生物都可用高压匀浆法破碎。
另外，有些坚硬的亚细胞器易损坏匀浆阀，也 不宜采用。
大肠杆菌 生长在复杂 培养基上比 生长在简单 培养基上更 坚固。
第一节 第二节 第三节
细胞破碎的分类 细胞壁的组成与结构 常用破碎方法 珠磨法 高压匀浆法 超声波破碎法 酶解法 化学渗透法 其它方法
第四节 破碎率的测定与破碎技术的研究方向
第一节 细胞破碎的分类
许多生物产品都存在于细胞内部（如胰岛素、干扰素）
很多基因工程产物都是胞内物质， 因此，细胞破碎是提 取这些成分的第一步，也是提取产物的关键性步骤，
关于破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生物工程学者 的关注。
二、细胞破碎的分类
细胞破碎的目的是释放出细胞内含物， 其方法很多，按照是否施加外力可分为 机械法和非机械法两大类。
机械法工业运用较为成熟，非机械 法的实验室研发也相当活跃。
机械法中的高速湿法珠磨和高压匀浆
法不仅在实验室被广泛运用，而且已经在工 业生产中应用。非机械法中的酶溶法和化学 渗透研究也较为成熟。新型破碎手段，如激 光破碎法、冷冻-喷射法、高速相向流撞击法 等的研究有待进一步深入和完善。
四、细胞壁结构与细胞破碎
细胞破碎就是破坏细胞壁网状结构的共价键，对于不 同的细胞，由于其细胞壁的组成及结构的差异，破碎的难 以程度不同。
对于机械破碎，细胞的大小和形状、细胞壁的厚度及 聚合物的交联程度，影响破碎的难以程度。个体小、球形、 厚壁、交联程度高的细胞难破碎。
对于酶法或化学溶剂法，细胞壁的组成特别重要，结 构次之。
高压匀浆一般需多级操作，每次循环前进行级 间冷却。提高压力有利于细胞破碎，但会增加能耗。
存在的问题 除了较易造成堵塞的团状或丝状 真菌以及较小的革兰氏阳性菌不适合此法外，其他 微生物都可用高压匀浆法破碎。
另外，有些坚硬的亚细胞器易损坏匀浆阀，也 不宜采用。
大肠杆菌 生长在复杂 培养基上比 生长在简单 培养基上更 坚固。
4第四章 微生物细胞的破碎
三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色， 2)目的产物测定法 而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得 3)导电率测定法 的标准数值比较，计算其破碎率。 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上 升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加 。
转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎 细胞破碎与固液分离紧密相关。 同样条件下破碎率只有32%。 与上游培养过程有关。 用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的 。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环 丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬 菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。
作业:
1. 常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、 超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、 特点及适用性。 2. 举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎 率的机理。
二常用破碎方法类作用机理分适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率可较大规模操作大分子目的产物易失活浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率可大规模操作不适合丝状菌和含有包含体的基因工程菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差破碎过程升温剧烈不适合大规模操作xpress法固体剪切作用破碎率高活性保留率高对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性条件温和浆液易分离溶酶价格高通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性浆液易分离但释放率较低通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结融化破碎率较低不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈易引起大分子物质失活细胞破碎机理图进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠石英砂氧化铝等研磨剂直径小于1mm一起快速搅拌或研磨研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切剂珠子与细胞之间的互相剪切碰撞使细胞破碎释放出内含物
第4章 微生物细胞破碎
2.植物细胞壁的化学组成和结构 植物细胞壁的化学组成和结构
成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁， 成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 细胞不再增大。 细胞不再增大。 初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝， 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。
（3）超声波破碎法 ）
影响超声波破碎的因素主要有超声波的声 强、频率、破碎时间、介质的离子强度、 频率、破碎时间、介质的离子强度、 pH、菌体的浓度和种类。 、菌体的浓度和种类。 一般杆菌比球菌易破碎， 细菌比G 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比 +细菌 易破碎，对酵母菌的效果较差。 易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时 细胞浓度一般在20％左右。 细胞浓度一般在 ％左右。
按细胞所受作用） 第二节 常用破碎方法（按细胞所受作用）
分 类 作用机理 适应性 可达较高破碎率，可大规模操作， 可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌 可达较高破碎率，可较大规模操作， 可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活， 分子目的产物易失活，浆液分离困难 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率较低， 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低， 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物 条件变化剧烈， 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 破碎率高，活性保留率高， 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合 具有高度专一性，条件温和， 具有高度专一性，条件温和，浆液易分 溶酶价格高， 离，溶酶价格高，通用性差 具一定选择性，浆液易分离， 具一定选择性，浆液易分离，但释放率 较低， 较低，通用性差 高压匀浆法 液体剪切作用 珠磨法 固体剪切作用
第四章 细胞破碎和分离提取技术 PPT课件
eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
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分离纯化包含体蛋白的基本步骤： 收集细胞→破碎细胞→分离包含体→包含体洗涤→
溶解包含体（目标蛋白变性溶解）→蛋白质产物的构型 复原（目标蛋白的复性）
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•溶解包含体：加变性剂溶解
常用6 mol/L盐酸胍替代8 mol/L脲溶解包含体。偶 而也可用1％ SDS溶解包含体，但在后面的步骤里较 难除去。
剂诱导细胞自溶）。
酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于
大规模工业操作，受影响因素多
15
三、细胞破碎率的评价
细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数。即：
Y=(N0-N)/N0×100%
• N0—原始细胞的数量 • N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数
于团状、丝状菌
✓处理能力可达0.1-100 m3/h
7
8
X挤压法（改进的高压匀浆法）
• 浓缩的菌体悬浮液冷却至-30 ℃ ~-25 ℃形成冰晶体，利用 500MPa以上的高压冲击
• 适用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低、活性保留 率高
• 主要用于实验室 • 对冷冻－融解敏感的生物物质不适合
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（三）化学破碎法
通过化学试剂使细胞壁和细胞膜结构改变或破坏。 常用有：酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等类别。
➢ 表面活性剂、碱——溶解细胞壁上的脂质或使细胞内组分渗漏。 表面活性剂如胆酸盐、SDS、Triton X-100、Tween等。
➢ 酸——蛋白质水解成氨基酸，常用6M HCl。 ➢ 有机溶剂——可溶解磷脂层，使细胞结构破坏。如丁酯、丁醇、
17
实际应用中，常采用多种方法结合： 主要为机械法与非机械法的结合，如 酶+高压匀浆 酶+超声 其他如：化学法+冻融法
18
五、基因工程包含体的纯化方法
包含体：外源基因在细胞内高度表达蛋白，因此 凝集而成的无活性固体颗粒。 包含体为致密凝聚体，密度较大，低速离心便 可沉淀，与细胞碎片和可溶性产物分离。
才能稳定）
2
2. 酵母：由酵母纤维素组成，主要成分是葡聚糖和 甘露聚糖
3. 霉菌：几丁质和葡聚糖 4. 植物细胞：纤维素、半纤维素、果胶、木质素等 5. 动物细胞：无细胞壁
3
二、常用细胞破碎方法
（一）机械破碎法
1.实验室方法(小规模)： 旋刀匀浆法图
• 通过固体剪切Байду номын сангаас进行破碎，剧烈 • 能完全破坏动、植物细胞，但酵母、细菌细胞不同 • 注意防止升温
细胞数的计算方法： 直接计数法：血球计数板 间接计数法：细胞破碎后，测定细胞悬浮液中特定细胞 释出物的浓度
16
四、细胞破碎方法的选择依据
应从以下方面考虑： ➢ 细胞的处理量 ➢ 细胞壁的结构、强度 ➢ 目标产物对破碎条件的敏感性 ➢ 破碎程度 具体的操作条件应从以下三方面进行权衡： • 高的产物释放率 • 低的能耗 • 便于后续提取
时间、液体的温度等 • 优点：操作简单，液量损失少。 • 缺点：易失活，噪声，大容量时声能不易传递、
不易散热。 • 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。
11
超声设备
探头式
（超声细胞破碎仪）
槽式
（超声清洗仪）
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（二）物理破碎法
反复冻融法
物理法总体不适于大规模生产， 因破碎率低、效果较差
• 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次
• 机理：冷冻促进细胞膜疏水键结构破裂，增强其亲水性能； 胞内水形成冰晶粒胀破细胞
• 缺点：溶质释放、扩散慢
渗透压破碎法（溶胀法） • 机理：低渗溶液细胞溶胀，也称渗透压冲击法 • 操作：一定体积的浓细胞液，加入2倍体积的水中 • 操作方法改进：细胞预先置于高渗介质中 • 特点：最温和，用于易破碎的细胞，如动物细胞、G-等
第四章 细胞破碎技术
生物分离的目的组分： • 胞内产物 • 胞外产物
细胞破碎的难易：
• 与细胞种类有关 • 与目的物的稳定性有关
细胞： 细菌 酵母 霉菌 动物细胞 植物细胞
1
一、细胞壁的结构
1. 细菌细胞壁结构： G+: 肽聚糖 G-: 外壁层为脂多糖
和磷脂、脂蛋白；内 壁层肽聚糖。 （脂多糖需Ca2+、Mg2+
丙酮、氯仿、甲苯等。
优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释 放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难， 从而影响最终纯度
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（四）酶法破碎法
应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再 结合其他方法破坏细胞壁。
✓ 细菌：溶菌酶，G- 还需加入EDTA ✓ 酵母：消解酶、β-葡聚糖酶、甘露糖酶、蜗牛酶 ✓ 霉菌：几丁质酶、蜗牛酶 ✓ 植物：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 ✓ 自溶法：细胞内酶（调节温度、pH或添加有机溶
•复性
最后采用透析或超滤除变性剂使蛋白质产物 的构型复原从而使蛋白质复性。
加谷胱甘肽等还原剂、氧化剂复性。
20
研磨法图
• 利用磨料与细胞间的剪切及碰撞作用，温和，常在研钵 内进行（或细胞匀浆器）
• 常用磨料：石英砂、氧化铝 • 增效方法：预先冷冻样液
4
旋刀匀浆器
5
研磨法仪器
研钵
细胞匀浆器
6
2.大规模方法： 高压匀浆法
•过程：高压(可达50-100Mpa)喷出—碰撞—释放到低压 •高压造成升温2-3℃/10MPa，需注意冷却料液 •影响因素：压力、循环次数、温度 ✓适用于酵母和绝大多数细菌，不适
高速珠磨法（beadmill）
•利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌 •提高破碎效率的方法：提高搅拌速度、增加小珠量、降 低细胞浓度、降低通过珠磨机的循环速率
9
高速珠磨机
10
3. 超声波破碎法（ultrasound）
• 超声波振荡器，15-25kHz的超声波 • 超声设备：槽式，探头式 图 • 超声波作用机理：空化作用 • 破碎作用影响因素：超声波的声强、频率、处理
溶解包含体（目标蛋白变性溶解）→蛋白质产物的构型 复原（目标蛋白的复性）
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•溶解包含体：加变性剂溶解
常用6 mol/L盐酸胍替代8 mol/L脲溶解包含体。偶 而也可用1％ SDS溶解包含体，但在后面的步骤里较 难除去。
剂诱导细胞自溶）。
酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于
大规模工业操作，受影响因素多
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三、细胞破碎率的评价
细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数。即：
Y=(N0-N)/N0×100%
• N0—原始细胞的数量 • N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数
于团状、丝状菌
✓处理能力可达0.1-100 m3/h
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X挤压法（改进的高压匀浆法）
• 浓缩的菌体悬浮液冷却至-30 ℃ ~-25 ℃形成冰晶体，利用 500MPa以上的高压冲击
• 适用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低、活性保留 率高
• 主要用于实验室 • 对冷冻－融解敏感的生物物质不适合
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（三）化学破碎法
通过化学试剂使细胞壁和细胞膜结构改变或破坏。 常用有：酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等类别。
➢ 表面活性剂、碱——溶解细胞壁上的脂质或使细胞内组分渗漏。 表面活性剂如胆酸盐、SDS、Triton X-100、Tween等。
➢ 酸——蛋白质水解成氨基酸，常用6M HCl。 ➢ 有机溶剂——可溶解磷脂层，使细胞结构破坏。如丁酯、丁醇、
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实际应用中，常采用多种方法结合： 主要为机械法与非机械法的结合，如 酶+高压匀浆 酶+超声 其他如：化学法+冻融法
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五、基因工程包含体的纯化方法
包含体：外源基因在细胞内高度表达蛋白，因此 凝集而成的无活性固体颗粒。 包含体为致密凝聚体，密度较大，低速离心便 可沉淀，与细胞碎片和可溶性产物分离。
才能稳定）
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2. 酵母：由酵母纤维素组成，主要成分是葡聚糖和 甘露聚糖
3. 霉菌：几丁质和葡聚糖 4. 植物细胞：纤维素、半纤维素、果胶、木质素等 5. 动物细胞：无细胞壁
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二、常用细胞破碎方法
（一）机械破碎法
1.实验室方法(小规模)： 旋刀匀浆法图
• 通过固体剪切Байду номын сангаас进行破碎，剧烈 • 能完全破坏动、植物细胞，但酵母、细菌细胞不同 • 注意防止升温
细胞数的计算方法： 直接计数法：血球计数板 间接计数法：细胞破碎后，测定细胞悬浮液中特定细胞 释出物的浓度
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四、细胞破碎方法的选择依据
应从以下方面考虑： ➢ 细胞的处理量 ➢ 细胞壁的结构、强度 ➢ 目标产物对破碎条件的敏感性 ➢ 破碎程度 具体的操作条件应从以下三方面进行权衡： • 高的产物释放率 • 低的能耗 • 便于后续提取
时间、液体的温度等 • 优点：操作简单，液量损失少。 • 缺点：易失活，噪声，大容量时声能不易传递、
不易散热。 • 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。
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超声设备
探头式
（超声细胞破碎仪）
槽式
（超声清洗仪）
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（二）物理破碎法
反复冻融法
物理法总体不适于大规模生产， 因破碎率低、效果较差
• 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次
• 机理：冷冻促进细胞膜疏水键结构破裂，增强其亲水性能； 胞内水形成冰晶粒胀破细胞
• 缺点：溶质释放、扩散慢
渗透压破碎法（溶胀法） • 机理：低渗溶液细胞溶胀，也称渗透压冲击法 • 操作：一定体积的浓细胞液，加入2倍体积的水中 • 操作方法改进：细胞预先置于高渗介质中 • 特点：最温和，用于易破碎的细胞，如动物细胞、G-等
第四章 细胞破碎技术
生物分离的目的组分： • 胞内产物 • 胞外产物
细胞破碎的难易：
• 与细胞种类有关 • 与目的物的稳定性有关
细胞： 细菌 酵母 霉菌 动物细胞 植物细胞
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一、细胞壁的结构
1. 细菌细胞壁结构： G+: 肽聚糖 G-: 外壁层为脂多糖
和磷脂、脂蛋白；内 壁层肽聚糖。 （脂多糖需Ca2+、Mg2+
丙酮、氯仿、甲苯等。
优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释 放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难， 从而影响最终纯度
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（四）酶法破碎法
应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再 结合其他方法破坏细胞壁。
✓ 细菌：溶菌酶，G- 还需加入EDTA ✓ 酵母：消解酶、β-葡聚糖酶、甘露糖酶、蜗牛酶 ✓ 霉菌：几丁质酶、蜗牛酶 ✓ 植物：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 ✓ 自溶法：细胞内酶（调节温度、pH或添加有机溶
•复性
最后采用透析或超滤除变性剂使蛋白质产物 的构型复原从而使蛋白质复性。
加谷胱甘肽等还原剂、氧化剂复性。
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研磨法图
• 利用磨料与细胞间的剪切及碰撞作用，温和，常在研钵 内进行（或细胞匀浆器）
• 常用磨料：石英砂、氧化铝 • 增效方法：预先冷冻样液
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旋刀匀浆器
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研磨法仪器
研钵
细胞匀浆器
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2.大规模方法： 高压匀浆法
•过程：高压(可达50-100Mpa)喷出—碰撞—释放到低压 •高压造成升温2-3℃/10MPa，需注意冷却料液 •影响因素：压力、循环次数、温度 ✓适用于酵母和绝大多数细菌，不适
高速珠磨法（beadmill）
•利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌 •提高破碎效率的方法：提高搅拌速度、增加小珠量、降 低细胞浓度、降低通过珠磨机的循环速率
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高速珠磨机
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3. 超声波破碎法（ultrasound）
• 超声波振荡器，15-25kHz的超声波 • 超声设备：槽式，探头式 图 • 超声波作用机理：空化作用 • 破碎作用影响因素：超声波的声强、频率、处理