微生物细胞破碎

不宜采用高压匀浆法的细胞类型：
易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
思考问题： 比较高压匀浆法与珠磨法性体 刚性体
喷雾撞击破碎器结构简图
3.喷雾撞击破碎
细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度）， 形成粒径小于5微米的微粒子。高速载气，氮气流速 300m/s，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞
细胞破碎机理图
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。
破碎的动力学方程为：ln[1／（l－R）]＝KNPα 其中 R——破碎率； K——与温度有关的速度常数； P一操作压力； N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。 α——与微生物种类有关的常数； 破碎酵母菌,α值可取2. 2。可见，影响破碎的主要 因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度 的细胞，常采用多次循环的操作方法。 一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较 处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的 细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下： 降低能耗 减少大分子目的产物的失活 减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易 分离而给后续操作带来的困难。
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization） ——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
例：单独用0.1mol/L盐酸胍处理E.coli仅释放约1%的蛋白质 0.5% TritonX-100处理蛋白质释放率为4% 二者合用，蛋白质释放率可达53%左右
机械破碎作用机制不同，有各自的适用范围和处理规
模。 适用范围：菌体细胞，目标产物。 破碎大肠杆菌提取质粒DNA，珠磨法完整质粒收得率 在90%,其他方法50%以下。因此针对目标产物性质
（分子量、分子形态、稳定性等）选择细胞破碎法，
并确定合适的操作条件非常重要。
机械破碎的缺点
需高能，并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学 组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露 聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层， 最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。
产品失活。 破碎的有机体或者产物，非专一，产生碎片微粒尺寸 的大范围细分布，大量的细微颗粒给后续分离造成困 难。
4.酶溶法（Enzymatic Lysis）
（1）外加酶法
溶菌酶 溶菌酶主要用于细菌类 β-1，3-葡聚糖酶 β-1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等
常用的溶酶
酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同 的酶），产物抑制的存在。 如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑 制葡聚糖酶。
（2）自溶法（Autolysis）
诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的 活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、 激活剂和细胞代谢途径等。常用加热法和干燥法。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的 变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双 分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜
结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来
高速珠磨机
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速 组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士 WAB公司和德国西门子机械公司制造）。
胶体磨
德国进口珠磨机
破碎作用方程
破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合 下列公式： ln[1/(1-R)]=Kt 其中 R — 破碎率； K一 一级反应速度常数； t一 时间。 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如如 搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃 小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。
微生物
壁厚/nm 层次
革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌
20-80 单层 10-13 多层
酵母菌
100-300 多层
霉菌
100-250 多层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.513.5%）
超声波破碎法
3.超声破碎法（Ultrasonication）
其破碎率的相关因素:
声频、声能； 处理时间 细胞浓度 菌种类型
与破碎效率直接相关的参数
振幅，与声能有关，直接影响蛋白释放的比速率
黏度，影响能耗，抑制空穴现象
表面张力，添加表面活性剂或者从细胞中释放出蛋白 质等活性物质，会显著影响超声破碎效率。起泡在气液界面上会使蛋白质变性或清除空穴现象。
5.化学渗透法（Chemical permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、 抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透 性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
（1）表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。
第四章
微生物细胞的破碎
知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞 的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法 的原理，操作过程及常用设备，并能就实际 生产情况予以合理的选择。
难点：常用破碎方法的合理选用。
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
影响超声对生物产品的回收有很多因素
（1）温度 避免方法 预冷 冷凝循环水 （2）游离基的生成等化学效应. 应对方式 添加游离基的清除剂{胱氨酸，谷胱甘肽或者利用氢 气顶吹细胞悬浮液来缓和}
微波破碎
基于微波加热的瞬时性、选择性、和高效性，控制适 宜的微波条件而实现。植物细胞不同部位的物质，对 微波的吸收能力存在显著差异。
不同细胞可采用的化学渗透处理方式
细胞类型 革兰氏阴 性细菌 革兰氏阳 性细菌 酵母菌 植物细胞 巨噬细胞 * 变性剂 清洁剂 * * * * * * * 表示适用 有机溶剂 * * * * * 酶 * * * * * * * * 抗生素 * 生物试剂 螯合剂 *
☀各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合 理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释 放率。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
高压匀浆器
大、中、小型高压匀浆器
多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生 空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和 剪切力，使细胞破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌 的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用（声能传递 和散热）。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。
被处理悬浮液的体积。大体积需要高的声能引起强烈 的涡流和大气泡的形成。
与破碎效率直接相关的参数
珠粒的体积和直径，对于刚性细胞的粉碎常添加细小
的珠粒以产生辅助研磨效应。 探头的形状和材质，一般是钛金属材料。 细胞悬浮液的流速。
由于其局限性，在工业上一般不采用，主要是用于 实验室规模的细胞破碎。
液体剪切作用
液体剪切作用 固体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和含有包含体的基因工程菌
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离， 非 溶酶价格高，通用性差 机 械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较 低，通用性差 法 渗透压法 冻结融化法 干燥法 渗透压剧烈改变 反复冻结-融化 改变细胞膜渗透性 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活