微生物细胞的破碎技术
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
细菌反复冻融破碎方法-概述说明以及解释
细菌反复冻融破碎方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细菌反复冻融破碎方法是一种常用的实验技术，用于破碎细菌细胞以释放其内部物质。
该方法通过将细菌悬浮液在低温条件下冷冻，并在适当时机进行快速融化，重复多次冻融循环，使细菌细胞膜失去完整性，从而实现有效破碎。
这种方法已被广泛应用于生物学、微生物学和分子生物学等领域的研究中。
细菌冻融破碎方法的关键在于冷冻和融化的过程。
在冷冻过程中，细菌细胞受到低温的刺激，使得细胞内的水分分子形成冰晶，从而引起细胞膨胀和压力增加。
而在融化过程中，细胞内的冰晶破裂，导致细胞膜的破碎。
通过多次反复冻融循环，可以增加细菌细胞膜的破碎率，从而获得更高的细胞内物质释放效率。
细菌冻融破碎方法具有多种优点。
首先，这种方法简单易行，不需要复杂的设备和试剂，适用于各种细菌样品。
其次，通过冻融循环，可以有效破碎细菌细胞，释放细胞内的物质，如蛋白质、DNA和RNA等，为后续的研究提供了可靠的样品。
此外，细菌冻融破碎方法还可以有效地保存细菌样品，避免了细菌的死亡和变质。
然而，细菌冻融破碎方法也存在一些局限性。
首先，该方法对细菌样品的处理过程需要严格控制，过程中的温度、时间和次数等因素都会对破碎效果产生影响，需要经验丰富的操作者进行操作。
其次，在某些情况下，由于细菌的尺寸较小或细菌细胞膜较厚，冻融方法可能无法完全破碎细胞膜，从而影响后续的实验结果。
因此，在具体应用中需要针对不同的细菌样品进行优化和调整。
总之，细菌反复冻融破碎方法是一种简单有效的实验技术，通过冷冻和融化的过程破碎细菌细胞，释放细胞内的物质。
该方法在生物学、微生物学和分子生物学等领域的研究中有着广泛应用，并且具有多种优点。
然而，在具体应用中还需根据不同的细菌样品进行优化和调整，以确保实验结果的准确性和可靠性。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照以下结构进行探讨细菌反复冻融破碎方法的要点：2.1 细菌冻融破碎方法要点1在本节中，我们将介绍细菌冻融破碎方法的第一个关键要点。
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
实验室常用的细胞破碎方法
实验室常用的细胞破碎方法
实验室常用的细胞破碎方法有物理法和化学法。
1、物理法
（1）反复冻融：将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下，反复冷冻溶解10次-20次。
适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。
（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
（3）超声法：将细胞放置于超声破碎仪中，以一定频率的超声破碎细胞，适用于绝大部分微生物细胞。
（4）渗透压法：将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液，细胞吸收大量水分破解。
（5）液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。
2、化学法
（1）强酸、强碱溶液：一般应用0.5N NaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
（2）生物酶：一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。
破坏细胞壁和细胞膜的方法
破坏细胞壁和细胞膜的方法破坏细胞壁和细胞膜是一项非常重要的技术，在微生物学、生物化学、生物工程等领域都有广泛的应用。
本文将介绍常见的破坏细胞壁和细胞膜的方法，并对它们的优缺点进行简要分析。
一. 物理方法1. 超声波破碎法超声波破碎法是一种以高频率机械振荡产生的声波为能量来破坏细胞壁或细胞膜的方法。
它的优点是操作简便，不需要任何酶或化学试剂，破碎效果好，但是需要注意的是，超声波的作用强度和时间要控制好，以免对感兴趣的分子造成损伤。
2. 研钵破碎法研钵破碎法是一种传统的细胞碎解方法，通过用研钵和石英砂对细胞进行摩擦和撞击破坏细胞壁。
它的优点是操作简单易行，装置成本低廉，不需要加入任何试剂，但是却有可能对细胞内部物质产生破坏。
二. 化学方法1. 高渗溶液法高渗溶液法是一种将高渗溶液与细胞混合并处理，使细胞失去渗透调节的能力而坏死的方法。
它的优点是对细胞壁和细胞膜都有破坏作用，可以同时破坏细胞内和外的膜结构，但是却可能对部分细胞内部物质产生破坏。
2. 酶解法酶解法是将特定的酶加入到细胞中，使其破坏细胞壁或膜的方法。
常用的酶有蛋白酶、纤维素酶、壳聚糖酶等。
它的优点是具有高度的选择性，可以中和细胞内的特定物质而不对其他分子造成伤害，但是操作较为繁琐，需要反复测定适当的酶浓度以及处理时间。
三. 其他方法1. 冷冻-解冻法冷冻-解冻法是将细胞低温处理后，进行快速升温解冻的方法。
这种方法可以使细胞壁和细胞膜受到冷冻和解冻的损伤而破坏。
它的优点是可以保存较多的细胞成分，避免部分物质受到酶解的影响，但是需要注意冷冻和解冻的速度和温度。
2. 电穿孔法电穿孔法是将细胞置于电场中，利用电场作用力使细胞膜产生微细孔洞，以便物质进出细胞的方法。
它的优点是可以具有选择性的穿过细胞膜，但是对于有机体而言，其穿透的效果相对有限，并且较难对细胞壁产生破坏.总的来说，各种破坏细胞壁和细胞膜的方法各有其优缺点。
在实际操作中，需要根据不同的研究目的选择恰当的方法，并进行有效的控制，以保证高效的细胞破碎效果。
微生物细胞的破碎
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
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化学法
优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少， 核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备 等优点，故使用较多。 缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随 后产物的纯化带来困难
总结：①酸碱容易造成产物水解或变性，慎用； ②表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂适合
包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间 折叠错误，故没有生物活性。
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
➢ 包含体形成的原因 1.缺少某些折叠的协助因子; 2.局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键; 3.包含体蛋白表达速度过快，表达量过高
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
• 超声波法
✓细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产
生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘 滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应 力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破 碎。
✓影响因素:功率、发射时间、次数、细胞悬浮
液体积
✓对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不
同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比 革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果 极差。
影响因素
• 操作压力（50～70MPa） • 细胞浓度（20％） • 温度 • 循环次数(2~5)
高压匀浆器
珠磨法
珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮 液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。 这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温 度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器 可得到部分解决。
• 渗透压冲击
✓是较温和的一种破碎方法，将细胞放在
高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液)，达到平衡后，介质被突然稀 释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由 于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞 内，引起细胞壁的破裂。
✓渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的
菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成 受抑制而强度减弱时才是合适的。
2. 细胞壁的组成和破碎阻力
细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自
于肽聚糖的网状结构。
酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻
力来自于壁结构交联的紧Байду номын сангаас程度和厚度。
丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几
丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结 构。
各种微生物细胞壁的结构与组成
3.微生物细胞的破碎技术
加低浓度变 性剂洗滤
除变性剂 复性
加变性剂 溶解
于绝大部分非蛋白类的物质；
• 酶解法
✓利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的
键，从而达到破壁的目的。
✓优点：专一性强，发生酶解的条件温和。
✓缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于
小规模的实验室研究。
✓溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分
解 细 胞 壁 上 糖 蛋 白 分 子 的 α-1 ， 4 糖 苷 键 ， 使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞 移至低渗溶液中使细胞破裂。
✓该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入
很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。
电声超声波发生器
• 化学法
• 化学法
采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞 内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有 机溶剂等化学试剂
✓ 酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱
和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分 从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有胆酸盐、磷脂、 SDS、CTAB、
高速珠磨机
珠磨法特点
• 破碎率较高 • 适合大规模细胞破碎 • 碎片较小，胞内物质释放完全 • 温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备 • 相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和
藻类
影响细胞破碎的因素
• 搅拌速度（700～1450r/min） • 料液的循环速度（50～500L/h） • 细胞浓度（0.3～0.5g/mL） • 珠粒大小和填充量 （0.45～1mm；70％～90％)
破碎技术的新进展
①多种破碎方法相结合：冻融法与匀浆法结合 破碎酵母，有效提高破碎率
②与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞 ③将细胞破碎与后续分离结合：珠磨法与双水 相萃取
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
➢ 什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的
没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。包含 体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA 和RNA聚合酶。
高压匀浆法
• 高压匀浆器
采用高压匀浆器是 大规模破碎细胞的 常用方法，利用高 压迫使细胞悬浮液 通过针形阀，由于 突然减压和高速冲 击撞击环造成细胞 破裂
高压匀浆法特点
• 破碎率较高 • 适合大规模细胞破碎 • 碎片细小，胞内物质释放完全 • 适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎;不适合霉
菌,因为容易造成堵塞;对革兰氏阳性菌破碎 效果较差
第3章 微生物细胞的破碎
知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的 破碎技术，破碎率的测定。
重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的 原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情 况予以合理的选择。
难点：常用破碎方法的合理选用。
1. 微生物细胞的破碎技术概述
胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身： 单细胞蛋白（SCP） 胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产 物等
➢ 包含分离的工艺路线
机械 破碎
离心提取 包含体
加变性剂 溶解
除变性剂 复性
化学破碎，溶解包 含体（加变性剂）
离心除细 胞碎片
除变性剂 复性
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
➢ 包含分离的工艺路线
机械 破碎
洗滤去除 可溶杂质
加变性剂 溶解
除变性剂 复性
机械 破碎
洗滤去除 可溶杂质
• 冻结-融化法
✓将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融
化，反复多次而达到破壁作用。
✓对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
但通常破碎率很低即使反复循环多次也 不能提高收率。另外，还可能引起对冻 融敏感的某些蛋白质的变性。
• 干燥法
✓可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥
和冷冻干燥等。
✓空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥
适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较 不稳定的生化物质。
✓干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白
质或其它组织变性。
机械破碎法与非机械法比较
4 破碎方法的选择
✓ 细胞的量 ✓ 破碎条件——目标产物对破碎条件的 敏感性 ✓ 破碎目标——待破碎细胞的机械强度
破碎率的测定
1.直接测定法 2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导 率