微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
（3） 酶解法
原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊 的键，从而达到破壁目的。
常用的溶酶
溶菌酶： 主要用于细菌类 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择 适当的酶，并确定相应的次序。
如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘 露糖结构，使两者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层， 最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。
超声波破碎机的使用步骤
1．功率调整到最小值的位置。 2．设定：工作次数、超声时间（工作时间）、间隙
（间歇）时间。 3．打开开关，开机后电源指示灯亮。 4．保护复位；工作复位。 5．显示屏开始显示工作的设定数据。 6．调节功率至所需数值。 7．工作至总次数为零时候，仪器处于停振状态。如
重复实验，可按工作复位键；否则，关机，并切 断电源。
NaH2PO4•2H2O：Mr=178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L; NaHPO4•12H2O：Mr=358.22，0.2mol/L溶液为71.64g/L; NaH2PO4•2H2O：Mr=156.03，0.2mol/L溶液为31.21g/L; NaH2PO4•H2O：Mr=138.01，0.2mol/L溶液为27.6g/L。
《生物分离工程实验》
微生物细胞破壁及破细胞破碎的方法。 2、 掌握研磨法、超声波、酶解法破碎细
胞的原理、方法。 3、 掌握细胞破碎率的测定方法。
实验原理
1、微生物细胞的破碎
细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。 微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支撑 细胞的作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，由于不同 微生物细胞壁的结构的不同，所采用的细胞破碎方法和条件 也有所不同。
（3）测定导电率
导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相 中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增 加。
因为导电率的读数取决于微生物的种类、处 理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含 量，因此应预先采用其他方法来进行标化。
材料准备
1. 酵母、巨大芽孢杆菌等。 2. 超声波破碎机、离心机、紫外分光光度计、研钵。 3. 烧杯（250ml）、塑料管（80ml）。 4. 无菌水、冰水、0.2mol/l磷酸盐缓冲液。 5. 显微镜（油镜）。 6. 载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯及火柴。 7. 结晶紫染液、Lugol’s碘液、95％乙醇、番红染液。 8.溶菌酶
超声波破碎机使用注意事项
1. 按样品的多少选择适当的容器（试管或各种烧杯 及离心管），固定好，调节好振动系统的位置。
2. 变幅杆末端插入样品液面10～15mm，并使其在容 器的中心位置，不得让变幅杆与容器相接触。变 幅杆末端离容器一般应大于30mm，量小时，功率 开小情况下可大于10mm。
3. 设定：工作时间不宜开的过长，1～10秒内选用； 间隙时间应大于工作时间。
缺点及适用范围：
超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在 细胞悬液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
对于不同菌种，超声波处理的效果不同，杆菌比球菌 易破碎，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎，对酵母 菌的效果差。
影响超声波破碎效率的参数:
① 振幅 • 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 ② 细胞悬浮液的粘度 • 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。
特点：
（2） 超声波法
超声波破碎是应用较多的一种破碎方法。其特点是简便、快捷、 效果好，特别适用于微生物细胞的破碎。
原理：
超声波破碎机通常在15-25 kHz的频率下操作，细胞是由于超声 波的空穴作用而破碎。空穴泡受到超声波的冲击而产生很强的 冲击波压力，引起粘滞性旋涡，在介质中悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声波 破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系，同时受细胞浓 度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等因素有关。
Y(%)＝[(N0- N)/N0]× 100 由于N0(原始细胞数量)和N (经t时间操作后保留下 来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此 破碎率的评价非常困难。 目前N。和N主要通过下面的方法获得。
（1）直接测定法
利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞 数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中 所释放的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数， 此时可采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞 中区别开，以便于计数。
优点: • 产品释放的选择性高; • 抽提的速率和收率高; • 产品的破坏最少; • 对pH值和温度等外界条件要求低; • 不残留细胞碎片。
缺点：
溶酶价格高，通用性差（不同菌种需选择不同的酶）， 产物抑制的存在。
如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖 抑制葡聚糖酶。
2、破碎率的测定
破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量 的百分比数，即:
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破 碎缓冲液中。
• 酶解：称取适量酶，加入菌悬液中，使酶最终浓度为 4mg/ml，37℃条件下反应1h。
• 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、 脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
附录
缓冲液配制
pH 7.5， 0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的配制： 0（.2m1o6l./0LmNLa2）HP混O匀4溶液（ 84.0 mL）0.2mol/LNaH2PO4溶液
③ 表面张力 ④ 被处理悬浮液的体积
大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。 ⑤ 珠粒的体积和直径
添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形 成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提高破 碎效率。
⑥ 探头的形状和材料
⑦ 细胞悬浮液的流速
在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时 间，并影响破碎的总收率。 声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采 用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够 的能量是很困难的。
• 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、 脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
2、超声波破碎
• 细胞培养和收集：将活化巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期 后(约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心 20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞 破碎缓冲液中。
生化分离技术 第二章 细胞的破碎
第二节 细胞壁的破碎
破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一. 在用球磨法破碎细胞的过程中,影响因素有以下几个方 面: (1)搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加,剪切力增大, 细胞破碎量增大,但是高的能量消耗,高的热量产生和磨球 的磨损以及因剪切力引起产物失活,因此对于给定处理量和 对蛋白质的释放要求下,存在着最佳效率点.实际生产中, 搅拌器外缘速率控制在(5～15)m/s之间.
1 x = exp(kt )
式中 x——为释放蛋白质的分率; k——为蛋白质释放常数,min-1; t——为超声波发射时间,min.
(2-5)
蛋白质释放常数k取决于输入声能,由实验确定.对于 从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液),用190声瓦的 20HZ声频的超声波处理时: k=b(P-P0)0.9 (2-6)
第二节 细胞壁的破碎
式中 b——为常数; P——为输入功率,J/(kg.s); P0——为由超声波引起的空穴的临界功率,J/(kg.s). 当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量,当产生的气 泡破裂时,绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收, 为避免高温,在破碎池中设计了冷却水夹套,并在开始时先 把悬浮液冷却至0℃～5℃,并不断将冷却液连续通过夹套, 短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作,以防止高温使 蛋白质变性. 为提高破碎效率,在破碎池中可添加细小的球粒(可以 是钢制的或玻璃的),以产生"研磨"效应,提高细胞破碎 率. 超声波破碎是实验室常用的一种普通方法,由于向大量 的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难,因此在工业还未 采用.
第二节 细胞壁的破碎
Y % = [ ( N 0 N ) N 0 ] ×100%
式中 N0——原始细胞数量; N——经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数 量. N0和N可由直接计数法和间接法求得. 直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计 数法进行计数. 间接计数法是在细胞破碎后,将悬浮液离心分离,除去细 胞碎片,未破碎的细胞及其他悬浮物,然后对清液进行蛋白质 含量或酶的活性进行分析.通过细胞释放出来的化合物的量R 与所有细胞理论最大释放量Rm的比值R/Rm,求出破碎率. (2-3)
细胞破碎(cell disruption)
细胞破碎（cell disruption）定义:细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.1细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌，肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：细胞壁更厚植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁具有很高的机械强度2 细胞破碎技术机械法和非机械法2.1机械法机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法高压匀浆器影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。
高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.高速珠磨机(high spced bead mill) 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响.超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法2.2 非机械法非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等.1)酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。
酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。
酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广.渗透压冲击法冻融法干燥法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。
微生物细胞的破碎
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
下游加工过程
下游加工过程：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的，动植物细胞组织培养的，酶反应等各种生物工业产生过程获得的生物原料，经提取分离，加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
下游加工的一般步骤：1预处理和固液分离（目的：改变发酵液的性质，便于固液分离及提取）2提取（目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件）3精制（目的：除去与产物的物理化学性质比较相近的杂质）4成品制作清洁生产：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以减少对人类和环境的风险。
下游技术中的物理过程；1平衡分离过程，这种操作是建立在相平衡关系上的。
例如蒸发，蒸馏，干燥结晶等2拟平衡分离过程，在混合体系外加上一个能引起物质分离的势能场。
例如离心分离，电泳等3非平衡分离操作，利用物质移动速度差和广义的，基于屏蔽效应的分离操作。
例如超滤，反渗透膜等下游技术化学过程一化学性分子识别：1分子间相互作用2分子识别二化学反应。
例如柠檬酸工业中常用石灰乳与柠檬酸反应生成溶解度很低的柠檬酸该盐沉淀。
亲和色谱，手臂也就是连接担体和配体的隔离基，以便配体再结合蛋白质时不引起立体障碍。
如何改变发酵液特性：一降低液体粘度：降低粘度可以提高过滤速率，方法有加水稀释和加热等二调pH 三凝聚与絮凝凝聚：指在电解质的作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
凝聚值越小，即凝聚能力越大絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
四加入助滤剂五加入反应剂杂蛋白质的除去:沉淀法，变性法，吸附法过滤装置：1板框式过滤机2真空转鼓过滤机：四区：卸渣区，再生区，过滤区，洗涤吸干区。
细胞破碎率：1直接测定法即计数破碎前后细胞数。
2目的产物测定法即测定目的产物的释放量3导电率测点法分子萃取：相似相容原理：1分子结构相似2能量相似，在生物工业中，的对后一点考虑的主要是分子极性，介电常数越大，极性越大超临界流体：就是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点———临界点后的流体。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
游技术第三章细胞破碎
不宜采用高压匀浆法。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。
易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。
3.反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
4.干燥法
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合
非 机 械 法
酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差
化学渗透法
改变细胞膜的渗透性
具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差
渗透压法
渗透压剧烈改变
破碎率较低，常与其他方法结合使用
冻结融化法
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。
化学渗透法（Chemical permeation）
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
细胞破碎方法课件PPT
通过离心法或过滤法分离出未破碎细胞和细胞碎片，然后通过显微镜观察或细胞计数器测定细胞数量，计算破碎 率。
蛋白质的提取率
提取率
破碎后可溶性蛋白质占细胞内总蛋白质 的比例，反映了蛋白质的释放和提取效 果。
VS
测定方法
通过考马斯亮蓝法或紫外吸收法测定可溶 性蛋白质的含量，再与细胞内总蛋白质的 含量进行比较，计算提取率。
细胞破碎方法课件
• 细胞破碎概述 • 物理法 • 化学法 • 生物法 • 破碎效果的评估
01
细胞破碎概述
细胞破碎的定义
01
细胞破碎是指通过物理或化学手 段将细胞壁和膜结构破坏，释放 出细胞内含物的过程。
02
细胞破碎是生物制药、生物燃料 、生物化学品等领域中常用的技 术手段，用于获取细胞内含物并 应用于各种生产和研究。
细胞破碎的原理
细胞壁和膜结构的机械性质
细胞壁和膜结构是细胞的保护层，具有抵抗内部压力和维持细胞形态的作用。 通过施加外力或改变环境条件，可以破坏细胞壁和膜结构，实现细胞破碎。
细胞内含物的释放
细胞破碎后，细胞内的水分、离子、有机物等物质会释放出来，这些物质可以 用于提取、分离和纯化等下游操作。
细胞破碎的方法分类
详细描述
通过瞬间释放高压水流或高压气体，使细胞受到强大的冲击力而破碎，这种方法 破碎效率高，但设备成本较高。
03
化学法
酶解法
总结词
利用酶分解细胞膜上的蛋白质或其他成分，使细胞膜破裂， 释放出细胞内的物质。
详细描述
酶解法是一种温和的破碎方法，适用于破碎各种类型的细胞 ，包括动物细胞、植物细胞和微生物细胞。酶解法的优点在 于对细胞内物质的破坏性小，能够保持细胞内物质的生物活 性。常用的酶有蛋白酶、酯酶和糖酶等。
经典：第三章-微生物细胞破碎
7
一、细菌细胞壁 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成份，
它是一个大分子复合体，由多糖链借短肽 交链而成。
细菌破碎的主要阻力来自肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取 决于多糖链上存在的肽键数量和其交链程 度，交链程度越大，网状结构越致密，破 碎难度越大。
8
革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图
9
46
微生物细胞的自溶法常采用加热法或 干燥法。
工业生产的典型例子是酵母自溶物制 备。
自溶法的缺点：对不稳定的微生物， 易引起目的蛋白质的变性，此外，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。
47
五、化学渗透法(Chemical permeation)： 利用一些化学试剂，如有机溶剂、变性
剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等， 以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从 而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理 方式称为化学渗透法。
中试规模：胶质磨 工业规模：高速珠磨机
22
破碎作用符合一级动力学； 破碎程度用细胞破碎率（%）或单位细 胞释放的内含物（mg/g）表示。
23
细胞破碎动力学方程：
24
25
延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌 转速和操作温度等都可有效地提高细胞破 碎率。
高破碎率将大大增加能耗；温度升高； 大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不 易分离。
图革 兰 氏 阳 性 菌 细 胞 壁 结 构 模 式
10
二、酵母菌细胞壁： 酵母菌细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主
要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、 蛋白质（6-8%）和脂类。
酵母细胞壁结构可分成三层：最里层葡聚糖层， 构成细胞壁的刚性结构，使细胞具有一定的形状； 最外层是甘露聚糖层；葡聚糖层和甘露聚糖层依 靠处于中间层的蛋白质交链在一起，形成网状结 构。
微生物细胞破碎原理与技术
对于含有酶的细胞破碎产物，酶的活性是评价产物质量的重要
指标。
细胞内重要代谢物
02
对于特定微生物细胞破碎产物，细胞内的重要代谢物的含量也
是评价产物活性的指标之一。
细胞免疫活性
03
对于具有免疫活性的细胞破碎产物，免疫活性是评价产物质量
的重要指标。
04
微生物细胞破碎技术的前景与挑战
微生物细胞破碎技术的发展前景
微生物细胞破碎的应用
80%
蛋白质提取
通过破碎微生物细胞，可以提取 和纯化细胞内的蛋白质，用于酶 工程、生物制药等领域。
100%
酶的提取
酶是微生物细胞中的重要组成部 分，通过破碎细胞可以提取各种 酶，用于催化化学反应和工业生 产。
80%
代谢产物的提取
微生物在生长过程中会产生许多 具有生物活性的代谢产物，通过 破碎细胞可以提取这些产物，用 于药物研发和生物技术领域。
颗粒物质，提高破碎效果；在破碎后进行后处理，如离心、过滤、纯化
等，提高产物的纯度和质量。
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感谢聆听
破碎能耗
破碎过程中的能量消耗也是评价破碎效率的指标之一。
细胞破碎产物纯度评价
02
01
03
杂质含量
破碎产物中杂质的含量越低，产物的纯度越高。
蛋白质含量
破碎产物中蛋白质的含量也是评价产物纯度的指标之 一。
细胞内含物残留
破碎产物中细胞内含物的残留量越少，产物的纯度越 高。
细胞破碎产物活性评价
酶活性
01
微生物细胞破碎原理与技术
目
CONTENCT
录
• 微生物细胞破碎概述 • 微生物细胞破碎技术 • 微生物细胞破碎效果评价 • 微生物细胞破碎技术的前景与挑战
酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定
一、酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定一、实验原理1.超声波破碎细胞的实验原理频率超过15～20kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250W），通过超声波发生器和换能器的作用, 将电能转换为声能，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而起到破碎细胞等物质的作用。
2.采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在270～280nm具有一个紫外吸收高峰。
在一定范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯比尔定律。
由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及所处的微环境不同，故蛋白质溶液在280nm的吸光度值不同。
3.血球计算板使用原理计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
a.16格×25格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数b. 25格×16格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数二、实验流程图1.啤酒酵母的破碎啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数（采用紫外分光光度计定性检测蛋白）→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容测OD280器中，浸没超声发射针1 cm ；频率中档超声4 s，间歇6 s，80-120次；0.5 ml 悬液稀释1000倍，电子显微镜观察、计数；另取1.5 ml酵母破碎液12000 r/min定性检测蛋白的释放情况；留4 ℃离心10 min取上清，紫外分光光度计测OD280取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。