第三章 细胞破碎

不能单纯追求高破碎率， 不能单纯追求高破碎率，随意增加操作 压力。 压力。
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 阀座形式： 阀座形式： 在相同的操作压力下，刃缘阀座比平 在相同的操作压力下， 边阀座破碎率高，但更易磨损。 边阀座破碎率高，但更易磨损。
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 浓度： 浓度： 一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关 一般认为， Doulach等人通过理论分析，认为破碎 Doulach等人通过理论分析， 等人通过理论分析 率与细胞浓度存在下列关系： 率与细胞浓度存在下列关系：
R = 1 − exp − p − p
{ [(
3.3 细胞壁的破碎
表3.2 细胞对破碎的敏感度
细胞 动物细胞 革兰式阴性芽孢杆菌和球菌 革兰式阳性芽孢杆菌 酵母 革兰式阳性球菌 孢子 菌丝 声波 7 6 5 3.5 3.5 2 1 搅拌 7 5 （4） ） 3 （2） ） （1） ） 6 减压 7 6 5 4 3 2 （1） ） 冷冻压力 7 6 4 2.5 25 1 5
3.3.2 破碎方法
动力学方程： 动力学方程：遵循一级动力学方程
㈠ 珠 磨 法
dR = k ( Rm − R ) dt
... 3.1
R：t时间内释放的蛋白质数量（mg/g） ： 时间内释放的蛋白质数量（ ） Rm：能释放的蛋白质最大数量，即100％破碎 能释放的蛋白质最大数量， ％ k：破碎的比速率 ：
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
HC23图3.3 HC23-高压细胞 破碎机
图3.4 DY89-1 型电动 玻璃匀浆机
㈡ 高 压 匀 浆 法
作用机理： 作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀 之间的环隙高速(可达到450m s)喷出后撞击 450m／ 之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后， 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急 剧释放到低压环境， 剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等 综合作用下破碎。 综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常 为50～70MPa。 50～70MPa。
第三章
细胞破碎 与分离 3.1 概述 3.2 细胞壁的结构及组成 3.3 细胞壁的破碎 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性
3.1 概述
胞外产物 霉菌产生糖化酶等 胞内产物 基因重组产品等 分离纯化方法： 分离纯化方法： 使用分泌性宿主， ⑴ 使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外
⑵ 细胞破碎 物理法，化学法，机械法， 物理法，化学法，机械法，酶法
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 温度： 温度： 破碎率随温度的增加而增加 例如：操作温度由5℃增加到30℃ 例如：操作温度由5℃增加到30℃ 5℃增加到 破碎率约提高1.5 1.5倍 ，破碎率约提高1.5倍。 高温对破碎有利， 高温对破碎有利，但应考虑热变性 压力每增加10MPa 温度2℃ 10MPa， 2℃。 压力每增加10MPa，温度2℃。
3.3.2 破碎方法
㈠ 珠 磨 法
原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动， 原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球 和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨 ，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎 产热由夹套带走。 。产热由夹套带走。
珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体 珠磨机主体： 一般，卧式比立式珠磨破碎效率高： 一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为 立式机中向上流动的液体在某种程度上会 使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。 使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。 研磨珠：玻璃(密度为2.5g／ 研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化 2.5g 密度为6.0 g／ 微球(粒径约0.1 0.1～ 锆(密度为6.0 g／cm3)微球(粒径约0.1～ 10mm)，填充率为80％～85％。 10mm)，填充率为80％～85％。 80％～85
k ∝u
... 3.3
该式有一定的适用范围， 该式有一定的适用范围，转盘外缘速度增 加到一限定值后， 加到一限定值后，蛋白质释放就不再增加
珠体积； 珠体积； －70%珠体积；∆－ 80%珠体积； 珠体积 珠体积 Ο－85%珠体积 珠体积

图3.5 搅拌速率与蛋白质释放的关系
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法 转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加， 转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加， 但产生的热量和消耗的功率也增加。 但产生的热量和消耗的功率也增加。破碎 效率E被定义为： 效率E被定义为：
1 ln = kpα N 1− x
K:与温度， K:与温度，粘度等有关的速率常数 与温度 2.9（酿酒酵母）；2.21(大肠杆菌 ）；2.21(大肠杆菌) α：2.9（酿酒酵母）；2.21(大肠杆菌)
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法 影响细胞破碎的因素： 影响细胞破碎的因素： 温度 压力 循环操作次数 细胞浓度 阀座形式
3.3.2 破碎方法
破碎方式 机械法 固体剪 切作用 液体剪 切作用 超声 破碎 非机械法 干燥 处理 溶胞 作用
高压 珠磨法 压榨 匀浆
酶溶法 化学法 物理法
图3.2 细胞破碎方法分类
3.3.2 破碎方法
图3.3 细胞破碎机理
3.3.2 破碎方法
㈠ 珠 磨 法
生产厂商: 生产厂商 瑞士WAB 瑞士 公司 德国西门子 机械公司 形式： 形式： 立式 效率高） 卧式（效率高） 图3.4 珠磨机简图
∫
R
0
t dR 1 = ∫ kdt ⇒ Ln = kt Rm − R 0 1− x
... 3.2
其中： ＝ 其中：X＝R/Rm，破碎率
3.3.2 破碎方法
㈠ 珠 磨 法
影响破碎效率的因素： 影响破碎效率的因素： 转盘外缘速度 细胞浓度 珠粒大小及装载量 温度 流速
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法 转盘外缘速度： 转盘外缘速度： 在一定范围内， 在一定范围内，破碎的比速率与外 缘速度成正比
3.3 细胞壁的破碎
破碎方法的选择： 破碎方法的选择： 破碎目的
待破碎生物体的类型 破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗； 破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗； 研究胞内产物在体内的功能， 研究胞内产物在体内的功能，宜 采用软处理。 采用软处理。 待破碎生物体的类型： 待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不 同的敏感度（见表3.2 3.2） 同的敏感度（见表3.2）
㈠ 珠 磨 法
微生物类型： 微生物类型： 酵母较细菌在珠磨机中更易破碎 ，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞 的十分之一， 的十分之一，在高速珠磨机中不易破 碎。
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法
延长研磨时间，增加珠体装量， 延长研磨时间，增加珠体装量，提高基 本速度等均可提高细胞破碎率， 本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率 能耗加大 同时: 加大。 ，使能耗加大。同时: 产生较多热能，增加冷却控温的难度； 1、产生较多热能，增加冷却控温的难度； 2、大分子目的产物失活增加 细胞碎片较小，碎片不易分离， 3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续 操作带来困难。 操作带来困难。 因此,破碎率控制在80 以下。 80％ 因此,破碎率控制在80％以下。
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法
珠粒大小及装载量： 珠粒大小及装载量： 过少不， 过少不，不易破碎 过多，能耗大，热扩散性能降低， 过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高 不利搅拌，一般控制80％～90%. 80％～ ，不利搅拌，一般控制80％～90%. 对细菌，磨珠越 细菌， 小，破碎率越高 ；对酵母和藻类 ，存在最佳范围 实验室： 实验室：0.2mm 工业： 工业：不小于 0.4mm
电导率测定法：细胞破碎后， 电导率测定法：细胞破碎后，大量带电 荷的物质被释放到水相，使电导率上升 荷的物质被释放到水相， ，电导率随破碎率的增加呈线性增加。 电导率随破碎率的增加呈线性增加。 由于电导率与微生物的种类，处理 由于电导率与微生物的种类， 条件，细胞浓度，温度， 条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解 质含量有关，因此， 质含量有关，因此，正式测定应采用其 它方法测定标准曲线。 它方法测定标准曲线。
0
) Z] }
β
Z:常数； 临界压力； Z:常数；P：破碎压力；p0：临界压力； 常数 破碎压力； 取决于细胞浓度的参数；R:蛋白质的释放量 β：取决于细胞浓度的参数；R:蛋白质的释放量
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 压力： 压力：
P↑
R↑
T↑
磨损 ↑
能耗 ↑ （每 ↑ 100 MPa，能耗 ↑ 3.5KW）
图3.7 微珠直径对破碎率的影响
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法 温度： 温度： 热稳定性，目的产物不受破坏 热稳定性， 夹套冷却
影响破碎效率的因素
流量： 流量：
㈠ 珠 磨 法
Q↑ Q↑
k↓ V t= ↓ Q 释放量↓ 处理能力 ↓
破碎量↓ 但Q ↓
图3.8 流量对破碎速率常数的影响
影响破碎效率的因素
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素 动力学方程： 主要有压力、循环操作次数和温度。 主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率 与操作压力P和循环操作次数N X与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表 达为：（服从一级反应规律) ：（服从一级反应规律 达为：（服从一级反应规律)
3.3.2 破碎方法
㈢ 超 声 波 法
图3.5 JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 JY92-
3.3.2 破碎方法
㈢ 超 声 波 法
作用机理： 作用机理：
在超声波作用下， 在超声波作用下，液体发生空化作用 (cavitaton)，空穴的形成、 (cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超 声波的细胞破碎效率与细胞种类、 声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。 声波的声频、声能有关。