重组乙肝疫苗 汉逊酵母 的介绍
重组酵母乙肝疫苗产品介绍
➢ 流行病学部分 增加2006年全国乙肝血清流行病学调查结果 ➢ 预防部分 乙肝疫苗接种对象：增加15岁以下儿童补种 无应答者处理：增加60 μ g乙肝疫苗接种 增加入学和就业体检不检测HBV标志物；乙肝疫
苗免疫前可以不筛查HBV标志物
中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会。中国病毒病杂志，2011,1:9-23
Hale Waihona Puke 问题？谢谢！试验设计总体思路
▪ 筛查4~5万表面抗原阴性并未接种乙肝疫苗的成人
▪ 用金标法现场筛查出表面抗原阴性者约3万人
▪ 用10ug乙肝疫苗进行三针全程接种 ▪ 筛查10ug乙肝疫苗全程接种后的无/弱应答者
▪ 在10ug乙肝疫苗全程接种后1个月用金标法现场筛查表面抗 体，估计金标法现场筛查表面抗体 2~3万人；对初筛表面抗 体阴性者约5千人采集静脉血用放免定量表面抗体检测法确 证其表面抗体达不到保护性水平（未产生抗-HBs或抗体滴 度<10mIU/ml），即无/弱应答者
60μg/1.0ml/支
10μg/支 20μg/支 10μg/0.5ml/支 20μg/ml 10μg/0.5ml/支 20μg/1.0ml/支
不同剂量乙肝疫苗接种成人后阳转率比较
第1针 第2针 第3针
60μg
30μg
10μg
83.26 （358/430）
89.53 （385/430）
92.79 （399/430）
背景资料
乙肝疫苗
儿童
1992年纳入新生儿 计划免疫，2002 年调查显示3～12 岁儿童HBsAg阳性 率2.07%，较1992 年7.12%下降了 70.93%
成人
计划免疫外人群 1992～1995年全 国病毒性肝炎血清 流行病学调查表明， 一般人群 HBsAg 阳性率为9.7 %
两种乙型肝炎疫苗免疫效果比较
受 HBV 感染， 但仍有少部分婴儿未能幸免成为 HBV 携带者。免疫失败的主要原因是宫内感染， 从
而使儿童特异性免疫功能处于耐受状态。因而， 怎 样完全阻断宫内感染， 产前采取更加有效的干预措 施还需要进一步研究。
. 考文献
Yao JL. Perinatal transmission of hepatitis B virus infect on and vaccii
3 讨论
程接种后抗一 阳性率 90. 31%11， HBs 4 同时母亲 HBeAg 阳性不影响婴儿抗一 的产生说明了其对 HBs
体液免疫耐受的调节作用。 目前预防感染措施 的实施可使大部分婴儿免
我们采用历史对照临床试验方法， 属于非随机 非同期的对照试验， 两组可比性不及平行对照试验 好。但采用平行对照是有违伦理的， 故采用历史对 照。两组资料均是 由本科收集， 资料记录完整可
接种重组酵母乙肝疫苗 257 例， 其中2 例有发热反应， 体温在37. 5℃ 一 3-C,48 h 内恢复正常， 6 例接种部位 38. 有 局部肿胀， 诉头晕、 乏力， 均在 1 d 后恢复正常， 无其他严重 不良反应。经检侧 HbsAg 均为阴性， 无一例感染乙肝病毒， 抗 HB。 阳性 162 例， 抗体阳转率约为63% . 接种重组汉逊酵母乙肝疫苗 163 例， 仅有 3 例诉头痛、 乏力， d 后恢复正常， 1 无其他严重不良反应。经检侧 HbsAg 均为阴性， 无一例感染乙肝病毒， 抗-HBs 阳性 161 例， 抗体
靠， 标本的收集及检验方法一致， 两组除HBIG 干预
措施外其他特征的分布是均衡的， 因而减少了历史 对照对结果带来偏歧的可能性。 HBIG是一种含有高效价的乙肝表面抗体， 据报 道 HBIG 可通过胎盘进人胎儿体内， 能中和孕妇和胎
重组乙肝疫苗(汉逊酵母)的介绍
重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞ຫໍສະໝຸດ 4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
2. 乙肝疫苗的发展： 第一代乙肝疫苗
（血源性乙肝疫苗）
第二代乙肝疫苗 （基因工程疫苗）
cho细胞乙肝疫苗
重组酿酒酵母乙肝疫苗 （第一代重组酵母乙肝疫苗 ） 重组汉逊酵母乙肝疫苗 （第二代重组酵母乙肝疫苗）
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
(重组乙型肝炎疫苗)说明书
重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）说明书药品名称：通用名称：重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）成分和性状：本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入铝佐剂制成。
为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不含任何防腐剂。
有效成分：乙型肝炎病毒表面抗原。
辅料：氢氧化铝，氯化钠。
接种对象：本疫苗适用于16岁及16岁以上的乙型肝炎易感者。
作用与用途：接种本疫苗后，可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力。
用于预防乙型肝炎。
不良反应常见不良反应：一般接种疫苗后24小时内。
在注射部位可出现疼痛和触痛，多数情况下2～3天内自行消失。
罕见不良反应1：一般接种疫苗后72小时内，可出现一过性发热反应，一般持续1～2天后自行缓解，不需处理。
2；接种部位，中度的红肿，疼痛，一般持续1～2天后自行缓解，不需处理。
3：接种部位可出现硬结，一般1～2月可自行吸收。
极罕见不良反应1：局部无菌性化脓：一般要用注射器反复抽出脓液，严重时（如出现破溃）需扩创清除坏死组织，病时较长，最后可吸收愈合。
2：过敏反应：过敏性皮疹，阿瑟反应。
阿瑟反应一般出现在接种后10天左右，局部红肿持续时长，可用固醇类药物进行全身和局部治疗。
3：过敏性休克：一般在接种疫苗1小时内发生，应及时注射肾上腺素等抢救措施进行治疗。
禁忌：1：已知对该疫苗所含任何成分，包括辅料以及甲醛过敏者。
2：患急性疾病，严重性慢疾病，慢性疾病，的急性发作和发热期和发热者。
3：妊娠期妇女。
4：患未控制的癫痫和其他进行性神经系统疾病者。
注意事项：1：以下情况者慎用：家族和个人有惊厥史，患慢性疾病者，有癫痫史者，过敏体质者。
2：使用时应充分摇匀，如疫苗有裂纹，标签不清或失效者，疫苗瓶内有异物者均不得使用。
3：疫苗瓶开启后应立即使用。
4：应备有肾上腺素等药物，以备偶有发生严重过敏反应发生时急救用。
接受注射者在注射后应在现在观察至少30分钟。
5：注射第1针后出现高热，惊厥等异常情况者，一般不再注射第2针。
乙肝疫苗接种剂量标准
乙肝疫苗接种剂量标准乙肝疫苗是用于预防乙型肝炎的疫苗，其接种剂量标准对于确保疫苗的有效性和安全性至关重要。
以下是关于乙肝疫苗接种剂量标准的详细介绍。
一、乙肝疫苗种类及剂量目前，乙肝疫苗主要分为三种类型：重组乙型肝炎疫苗（酵母型和CHO细胞）、重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母表达），以及重组乙型肝炎疫苗（哺乳动物表达）。
每种疫苗的接种剂量可能存在差异，因此在实际接种前，需确保了解所使用疫苗的剂量标准。
二、乙肝疫苗接种剂量标准1.重组乙型肝炎疫苗（酵母型）：该疫苗适用于儿童及成人，通常需要接种三剂。
在接种第一剂时，儿童和成人分别使用5μg和20μg的剂量；第二剂在第一剂接种后1个月进行，剂量与第一剂相同；第三剂在第二剂接种后5-8个月进行。
对于某些免疫功能低下的人群，可能需要增加接种剂量。
2.重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）：该疫苗适用于儿童及成人，也需要接种三剂。
在接种第一剂时，儿童和成人分别使用10μg和20μg的剂量；第二剂在第一剂接种后1个月进行，剂量与第一剂相同；第三剂在第二剂接种后6个月进行。
同样，对于某些免疫功能低下的人群，可能需要增加接种剂量。
3.重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母表达）：该疫苗适用于儿童及成人，需要接种两剂。
在接种第一剂时，儿童和成人分别使用10μg和20μg的剂量；第二剂在第一剂接种后6个月进行，剂量与第一剂相同。
对于某些免疫功能低下的人群，可能需要增加接种剂量。
4.重组乙型肝炎疫苗（哺乳动物表达）：该疫苗适用于儿童及成人，需要接种三剂。
在接种第一剂时，儿童和成人分别使用10μg和20μg的剂量；第二剂在第一剂接种后1个月进行，剂量与第一剂相同；第三剂在第二剂接种后6个月进行。
同样，对于某些免疫功能低下的人群，可能需要增加接种剂量。
三、注意事项1.在接种乙肝疫苗前，应了解自己的乙肝病毒感染情况。
如果已经感染乙肝病毒，则无需接种疫苗。
2.在接种乙肝疫苗期间，应避免接触已知的乙肝病毒感染者或血液制品。
重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)对成年人初免和加强免疫的效果及安全性观察
者 注射 部位 疼 痛 、 晕 和 硬 结 的发 生 率 高 于安 慰 剂 红
组（ 分别 为 ６ ％和 ０ ， ０ ％ Ｐ一０ ０ ） ． ４ 。所 有疫 苗 玉麟 摘 赵 徐 闻青校 ）
分 泌细胞 的数 量 也 没 有 显 著 差 异 。４名 “ 切接 触 密 者” 在疫 苗接 种后 长 达 １ ２周 的监 测 期 间 ， 有人 出 没
现发 热 或 其 他 提 示 ＨＣ ＭＶ 病 的症 状 ， 没 有 人 排 也
出 ＨＣＭ Ｖ。
的 Ｔ ｌｄ ｏｅ ｏ株 的基 因组进 行重 组 ， 而构 建 了 ４ 独 从 种 立 的嵌 合体 候选 疫 苗 ， 对 其 安 全 性 和 耐受 性 进 行 并
果 ， 者采 用重 组 乙肝疫 苗 （ 逊酵 母 ） １ ￣４ 作 汉 对 ８ ０岁
抗一 ｓ 抗一 ｃ等 ５项 指 标 均 为 阴 性 ， 为 初 免 ＨＢ 、 ＨＢ 作
常住人 群进 行 了为期 ３ 个 月 的观察 ， 果如 下 。 ０ 结
１ 对 象与 方法
组 。在 同区选择 ４ ０名 既往 ３ ５年 有 乙 肝疫 苗接 ６ ～
者 均发 生 了局部 反 应 。在疫 苗接 种 后 ８周 期 间 ， ０ ２
名 疫苗 接 种 者 中 １ ４人 有 全 身症 状 ， ７ ； 占 ０ ５名 安 慰 剂接 种者 中 ２人有 全 身 症状 ， ４ 。疫苗 接 种 占 ０
４种 重 组 人 巨 细胞 病 毒 Ｔ ｗ ｅ Ｔ Ｉ ｏ嵌 合 体 活 疫 ｏ ｎ／ ｏｅ ｄ
１ １ 对象 选 择 ． 于 ２０ ０ ３年 １ ２月 在 郑 州 市 金 水 区 选 择 ４ ０名 ２
汉逊酵母与酿酒酵母乙肝疫苗对阻断HBV母婴传播的免疫效果比较
１ １ 对 象 ．
２ １ 年 ５月 ～ ０ １ ５月 ， 我 院妇 产 科 的孕 产 妇 ００ ２１ 年 对
基金项 目 ： 广州市白云区科信局科研基金项 目（ 编号：０ ０一Ｋ ｏ ） ２１ Ｚ— ６
冯 剑 辉 ： 州 市 白 云 区红 十 字 会 医 院 广 陈 立 林 ： 州 市 白云 区石 井 人 民医 院 广 广东广州 广东广州 ５０ ４ １５ ５ ５ ０ ３ １４ ０
结果 为 Ｈ ｓ ｇ阴性 的新生 儿 随 机分 为 汉 逊 酵母 疫 苗 （ ＢＡ 大
是 两组 同时联 合 乙型肝炎 免疫球 蛋 白（ ＢＧ 的免疫 效果 Ｈ Ｉ）
观察 ， 尚未 见使用 后抗 一ＨＢ ｓ应答 的相关 报道 。本研 究根
连疫 苗 ） 组和 酿酒 酵母 疫 苗 （ 泰疫 苗 ） ， 中汉逊 酵母 康 组 其 疫苗（ 大连疫 苗 ） ８ ， 组 ５人 酿酒 酵母 （ 泰疫 苗 ） ９ 人 。 康 组 １ 两 组 观 察 对 象 婴 儿 的 性 别 、 生 体 重 及 母 亲 Ｈ ｓ ｇ 出 ＢＡ 、
【 关键词 】 汉逊 酵母
酿酒酵母 乙肝疫苗 阻断 Ｈ Ｖ母婴传播 Ｂ
ｄ ｉ１ ．９ ９ ｊｉ ｎ １７ ｏ ：０ ３ ６ ／．ｓ ． ６ １—３ ２ ． ０ ２ ３ ０ ８ ｓ ３ Ｘ ２ １ ． ．２
接 种乙 型肝炎 （ 乙肝 ） 苗 是 预防 乙型 肝炎 的唯 一 有 疫 效 方法 。有关 汉逊 酵母 和 酿酒 酵母 重组 乙 肝疫 苗 对 阻 断
ＨＢ Ｖ母 婴 围产 期传 播免 疫 效果 的 比较 报 道 比较 少 ，特别
用 Ｅ ＩＡ 法常 规筛 查 乙肝 两对 半 ， ｓ ｇ和 Ｈ ｅ ｇ阳 性 ＬＳ ＨＢ Ａ ＢＡ 母 亲所 生的新 生儿 为研 究 对象 ， 人选 新 生儿 是 足 月 的 ， 一
一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810537430.5(22)申请日 2018.05.30(71)申请人 艾美汉信疫苗（大连）有限公司地址 116000 辽宁省大连市金州新区湾达路35-4号1-3层中国（辽宁）自由贸易试验区(72)发明人 李贵兴 张平 陈新亭 李纯厚 姜晓娟 刘立斌 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任公司 21212代理人 赵淑梅 李馨(51)Int.Cl.C12N 1/19(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C07K 14/02(2006.01)C12R 1/78(2006.01)(54)发明名称一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法(57)摘要本发明涉及一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，属于医药生物工程技术领域。
本发明所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤。
本发明中重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)细胞扩增、培养表达后的细胞密度比现有基因重组乙肝疫苗细胞扩增、培养表达的细胞密度更高，HBsAg表达量更高，且HBsAg颗粒结构完整，细胞颗粒大小均一。
权利要求书2页 说明书5页 附图5页CN 108715815 A 2018.10.30C N 108715815A1.一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤；所述发酵培养步骤为：取25L三级种子培养物接种于100-150L发酵培养基中，28-32℃培养88-95h；所述发酵培养基，按重量份，由下述组份组成：生长期的搅拌速度由200rpm增加至500rpm，pH值为4.85-5.25，空气流量由100L/min增加至300L/min，溶氧不低于10％；补料期保持生长期的发酵条件不变，当溶氧升至最大值时，加入8-10L甘油，反复6-8次；诱导期的搅拌速度由500rpm降低至450rpm，pH值为5.35-5.75，空气流量由150L/min降低至20L/min，溶氧为60-90％，并且，在加入最后一次甘油后溶氧升至最大值时，开始先流加体积比为1：4-6的甘油甲醇混合液25-30L，再流加甲醇70-80L，流加的速度为10-40mL/ min。
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疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生 长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添 加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地 改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度 分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到 pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提 高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。
分离纯化
发酵液
过滤
蛋白酶抑制剂
细胞破碎
表面活性剂
微滤
滤液
超滤
硅胶吸附
热硼酸
疏水层析
硫氰酸盐处理
氢氧化铝共沉淀
1.发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，
2. 加入蛋白酶抑制剂以防抗原在细胞破碎时被分解。
3.然后细胞通过高压匀浆机破碎释放出抗原。酵母细胞较 厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压， 通过针型阀突然降压到零使细胞破碎。
重组乙肝疫苗（汉逊酵母） 制备
Staff:
目录
1.背景介绍 2.重组酵母构建 3.菌种制备和发酵 4.分离纯化 5.纯度测定工艺 6.疫苗的保存
背景介绍
1.乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。我国乙肝感染率为60%，乙肝表 面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋 白是乙型肝炎病毒（HBV薄膜蛋白），主要包括，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,前S1抗 原和前S2抗原 2. 乙肝疫苗的发展：
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
重组酵母的构建
获取目的基因 构建重组质粒 导入宿主细胞
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞
4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
检测正确表达目的产 物的酵母
5.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的 基因工程菌。
9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
纯度测定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的 不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙 型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所 疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行 纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用 0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原 的纯度。
4.细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。
5.粗细胞裂解物用0.2微米中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分 6.滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子浪宿主细胞内含 物通过滤膜除去
7.残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去
8.再用硅胶吸附抗原，用热硼酸缓冲液洗脱
菌种的制备及发酵
重组酵母细胞 小三角瓶 大三角瓶 种子发酵罐
生产发酵罐
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发 酵罐。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机 和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产； 生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；生产 过程中考虑防止杂菌的污染。