耐万古霉素肠球菌的耐药与毒力基因检测
耐药机制及特殊耐药性检测知识点整理
耐药机制及特殊耐药性检测知识整理1.耐药类型1)靶位改变●MRSA：抗药性金黄色葡萄球菌●VRE：抗万古霉素肠球菌2)产酶●ESBL：超广谱β-内酰胺酶●AmpC： AmpCβ内酰胺酶●CRE：耐碳青霉烯类肠杆菌3)多重耐药●MDR-PA：多重耐药铜绿假单胞菌●MDR-AB：多重耐药鲍曼不动杆菌2.M RSA抗药性金黄色葡萄球菌1)耐药机制：MRSA携带mecA基因，可编码产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP2a），阻止药物与靶位的结合而造成耐药。
2)流行现状3)检测方法●1、苯唑西林的筛选平板。
不是甲氧西林！●2、常规药敏试验(苯唑西林MIC，头孢西丁MIC或纸片法)检测。
●3、mecA基因(PCR法)及其产物PBP2a(乳胶凝集试验)阳性均提示MRSA●抑菌圈内任何生长视为耐药。
4)检测●mecA和PBP2a：确定葡萄球菌属对甲氧西林(苯唑西林)耐药性最可靠的方法，阳性应报告为该菌株对甲氧西林(苯唑西林)耐药●苯唑西林筛选平板（显色平板）●常规药敏（苯唑西林MIC、头孢西丁MIC、纸片法）●PCR●金葡或所有凝固酶阴性葡萄球菌，如对苯唑西林(或甲氧西林)耐药，则对青霉素类、头孢菌素类(头孢罗膦除外)、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑其体外药敏结果。
3.V RSA-vanA耐万古霉素金葡1)定义：金黄色葡萄球菌对万古霉素●MIC＞16μg/ml——耐药●MIC=4-8μug/ml——中介●MIC＜2μg/ml——敏感。
2)耐药机制：葡萄球菌细胞壁有一段由4个氨基酸组成的短肽， 4肽的末端有2个重复氨基酸是万古霉素结合的靶位，由vanA基因介导的4肽末端改变为万古霉素低亲和力靶位，与万古霉素结合的亲和力下降1000倍。
3)检测方法：不推荐纸片法做万古霉素的敏感性检测4.V RE-vanA耐万古霉素肠球菌1)流行现状：几乎无药可治2)检测方法●肉汤或平板筛查法，万古霉素琼脂平板●纸片法、E-test●琼脂稀释法VRE筛选试验※3)耐药机制：vanA基因介导的4肽末端（D-丙氨酸- D-丙氨酸）改变为D-丙氨酸-D-乳酸4)结果解释：MIC高水平耐药，根据对万古霉素和替考拉宁耐药的程度可进⼀步区分为vanA、vanB、vanC、vanD等。
耐万古霉素肠球菌患者的临床分布特点及耐药性分析
耐万古霉素肠球菌患者的临床分布特点及耐药性分析作者：袁妍朱卫民来源：《中国药房》2022年第10期中圖分类号 R446.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）10-1253-05DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.10.16摘要目的研究耐万古霉素肠球菌（VRE）患者的临床分布特点及耐药情况，为临床预防及感染控制提供参考。
方法纳入2017年5月1日-2020年5月1日我院住院部各科室送检标本培养出肠球菌的患者，共290例，根据其药敏结果分为VRE组（24例）和万古霉素敏感肠球菌（VSE）组（266例）。
收集患者的基本信息（性别、年龄、送检科室等）、基础疾病（高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等）、临床事件（导尿、气管插管、深静脉置管等）、抗菌药物使用情况（检出前后抗菌药物使用情况及使用时间）、临床表现（炎症指标异常、临床症状等）、临床结局（住院时间、好转等）、药敏谱等，比较分析两组的临床分布特点及耐药情况。
结果两组患者检出肠球菌的菌种种类、混合感染菌株类型、临床表现均有明显差异（P关键词肠球菌;万古霉素;临床分布;耐药情况Analysis of clinical distribution and drug resistance of vancomycin-resistant EnterococciYUAN Yan，ZHU Weimin（Dept. of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）ABSTRACT OBJECTIVE To study the characteristics of clinical distribution and drug resistance in patients with vancomycin-resistant Enterococci （VRE）， and to provide reference for clinical prevention and control of infection. METHODS From May 1， 2017 to May 1， 2020， a total of 290 patients with Enterococci cultured from the samples submitted by inpatient department of our hospital were included. They were divided into VRE group （24 cases） and vancomycin-sensitive Enterococci （VSE） group （266 cases） according to the results of sensitivity tests. The basic information of patients （gender， age， submitting department， etc.）， basic diseases （hypertension， diabetes， chronic obstructive pulmonary disease， etc.）， clinical events （catheterization， endotracheal intubation， deep venous catheterization， etc.）， use of antibiotics （utilization and utilization time of antibiotics before and after detection）， clinical manifestations （abnormal inflammatory indicators， clinical symptoms， etc.）， clinical outcomes （length of stay， improvement， etc.）， drug sensitivity spectrum were all collected. Clinical distribution and drug resistance were compared and analyzed between 2 groups. RESULTS There were significant differences in the type of Enterococci， mixed infection strains and clinical manifestations between 2 groups （PKEYWORDS Enterococci; vancomycin; clinical distribution; drug resistance肠球菌（Enterococcus）广泛存在于土壤、水源等自然界中，是肠道正常菌群的组成部分之一，是除葡萄球菌（Staphylococcus）外最常见的导致院内感染的革兰氏阳性球菌[1]。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法 Prepared on 22 November 2020细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml 的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
肠球菌esp基因与万古霉素耐药的相关性研究
５６ ・
２ ０ １ ３年 ２月第 ７卷第 ４期
Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｍｏ ｄ Ｄ ｒ ｕ ｇ Ａ ｐ ｐ ｌ ， Ｆ ｅ ｂ ２ ０ １ ３， Ｖ ｏ １ ． ７， Ｎ ｏ ． ４
１ ． ５ 统计学方法
２ 结果
对数据 处理时采用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ０ ． ０系统软件 ，
心功能 ， 只要掌握好 用药剂 量 以及临 床适应 证 ， 即可 达到 良 好 的治疗效果 ， 值得在临床上大力 推广使用 。
参考文献
［ １ ］ 陈 锐祥 ． 倍 他乐 克 治疗 慢 性心 衰疗 效 观察 ． 亚 太 传 统 医药 ，
２ ０ １ ０， １ ３ （ ０ １ ） ： ６ １ － ６ ３ ．
注： 表示与治疗前相 比， 差异有统计学意义 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ）
３ 讨 论
的心脏毒性作用 。倍他乐 克还 可 以有效 的预 防室上 性心 律失常和室性心律 失常 ， 降低 心脏 发生 恶性 事件 的几率 ， 有 效 的延长 患者 的寿命 Ｊ 。本文 的研究 表明 ， 慢性 心衰患者 运 用倍他乐克治疗 的临床 效果较为显著 ， 能有效 的改善患者 的
些 认 证 Ｊ 。
倍 他乐克 能够选 择性 的阻断 Ｂ 受体， 对慢性 心衰 治疗
的关键是 降低周围循环阻力 以此来减轻 心脏后 负荷 ， 同时降 低心率和心肌耗氧量 ， 提高 Ｂ受 体 的敏 感性 ， 对抗 儿茶 酚胺
肠球 菌 ｅ ｓ ｐ基 因 与万 古 霉 素 耐 药 的相 关 性 研 究
采用 ￡ 检验 ， 差异有统计学 意义 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） 。
所选 的 １ ３ ６ 例患者 中 ， 慢性心衰经过治疗后 ， １ １ ４ 例 为显
万古霉素耐药肠球菌基因检测及同源性分析
ｍｅ ｈｏ ｔ ｄ ｓ ｔ ｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｈｅ ｔ ｈ ｏ ｍｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｉ ｙ ｔ ｏ ｆ ｖ ａ ｎ ｃ ｏ ｍｙ ｃ ｉ ｎ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ｎｔ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ．
【 Ｋ Ｅ Ｙ ＷＯ Ｒ Ｄ Ｓ 】 ｖ ａ ｎ ｃ ｏ ｍ ｙ ｃ ｉ ｎ ； ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ； ｄ ｍ ｇ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ； ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｅ ； ｇ ｅ ｎ ｅ
Hale Waihona Puke Ｖ０ １ ． ２ ８ Ｎ ｏ ． ２
・
专 题 报 道
・
万 古霉 素 耐 药 肠 球 菌 基 因检 测 及 同 源 性 分 析
刘志远 许淑珍 于艳 华
（ 首都医科大学附属北京友谊 医院检验科 ）
【 摘要 】 目的 检测肠球 菌万古霉 素耐药基 因， 分 析万古霉 素耐药 肠球 菌耐 药表 型及 基因同源性 。方法
维普资讯
２ ０ ０ ７年 ４月
首 都 医 科 大 学 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ｌ ａ ｏ ｆ Ｃ ａ ｌ ￣ ｉ ｔ ｌ ａ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Ａｐ ｒ ．２ ０ ０７
第２ ８卷 第 ２期
Ｖａ ｎ ｃ ｏ ｍｙ ｃ ｉ ｎ Ｒｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａｎ ｔ Ｅｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ
Ｌｉ ｕ Ｚｈ ｉ ｙ ｕ ａ ｎ，Ｘｕ Ｓ ｈ ｕ ｚ ｈ ｅ ｎ，Ｙｕ Ｙａ ｎ ｈ ｕ ａ
（ Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｆ ｒ ｉ ｅ ｎ ｄ ｓ ｈ ｉ ｐ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｃ ａ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ） 【 Ａ Ｂ Ｓ Ｔ Ｒ Ａ Ｃ Ｔ 】 Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｖ ａ ｎ ｃ ｏ ｍ ｙ ｃ ｉ ｎ — ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｏ ｆ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ， ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｅ ｓ ｎｔ ａ ｉ ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｐ ｈ ｅ ｎ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ ａ ｎ ｄ
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
肠球菌耐药性与耐万古霉素基因初步检测
肠球菌耐药性与耐万古霉素基因初步检测钱纯;宁兴旺【期刊名称】《中南医学科学杂志》【年(卷),期】2011(039)004【摘要】目的了解肠球菌对六种常用抗生素的耐药情况,同时检测耐万古霉素肠球菌(VRE)的耐万古霉素基因型.方法用K-B纸片琼脂扩散法检测肠球菌对万古霉素、替考拉宁、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星以及庆大霉素等六种常用抗生素的敏感性.采用合6μg/mL万古霉素的琼脂稀释筛选平板法(ADSP)筛选VRE菌株,并用多重聚合酶链反应(multiplex-PCR)检测VRE的耐万古霉素基因型.结果100株临床分离肠球菌中以粪肠球菌(86％)和屎肠球菌(11％)为主.除万古霉素和替考拉宁外,屎肠球菌对其它几种抗生素的耐药率明显高于粪肠球菌(P＜0.05)；庆大霉素高耐株检出率为54％,其对常用抗生素的耐药率明显高于低耐株(P＜0.05).用ADSP法筛选出3株(3％)耐万古霉素肠球菌,其中只有一株铅黄肠球菌为耐万古霉素基因型阳性(VanC2),其余两株均为Van基因阴性.结论 ADSP法用于筛选VRE较K-B法检出率高；本次研究只分离出一株VanC2型VRE,没有发现具有重要临床意义的VanA和VanB型VRE；肠球菌对庆大霉素(120μg/片)的耐药率为54％,建议临床慎用；万古霉素、替考拉宁、氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦均可作为治疗粪肠球菌感染的药物,但需密切注意肠球菌耐药情况.【总页数】4页(P422-425)【作者】钱纯;宁兴旺【作者单位】湖南中医药大学第一附属医院检验科，湖南长沙410007;湖南中医药大学第一附属医院检验科，湖南长沙410007【正文语种】中文【中图分类】R446.2【相关文献】1.258株肠球菌耐药性分析及耐万古霉素基因检测 [J], 马均;张彭;褚美玲;刘海洋;任微;王璐;薛文成2.肠球菌耐万古霉素基因及耐消毒剂基因检测的研究 [J], 王宏;黄健;谢忆虹;赵俊;罗秋平;郭露娟3.儿童肠球菌耐万古霉素表型和耐药基因检测分型的研究 [J], 张彩虹;张学忠4.肠球菌耐药性与耐万古霉素基因初步检测 [J], 钱纯;宁兴旺5.肠球菌耐药性分析及耐万古霉素基因检测 [J], 任微;王璐;马均;褚美玲;赵汐婷;刘海洋;孟冬娅;薛文成因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
耐万古霉素肠球菌耐药表型检测和基因型分析
耐万古霉素肠球菌耐药表型检测和基因型分析张侠家;沈继录;贾伟华【摘要】Objective To research the resistant characteristics, genotype and prevalence of vancomycin-resistant Enterococci( VRE) . Methods K-B disc diffusion method was used to determine the susceptibility, minimum inhibi-tory concentration ( MIC) for vancomycin of VRE was detected by E-test method;VRE was then subjected to PCR for resistance related genes;6 strains sequencing results of PCR product were contrastively analyzed the amino acid sequence by BLAST. Results 6 VREFm strains were found from 193 strains enterococci;6 VREFm strains were completely resistant to high unit gentamicin, ampicillin, ciprofloxacin, teicoplanin,but were sensitive to linezolid and macrodantin,MIC for vancomycin was more than 256mg/L;Genotypes were vanA;Amino acids in vanA gene have changed with Asn83→Asp( AAC→GAC) . Conclusion VRE in our hospital is mostly multi-drug resistant , which bringS difficulty in clinical treatment for its infection. So the hospital should strengthen the prevention and monitoring, to prevent the spread of VRE strains in the hospital and popular.%目的研究某院耐万古霉素肠球菌( VRE)的耐药特性、基因型及流行情况。
检验科细菌耐药性监测标准操作程序SOP文件
检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。
（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。
苯唑西林纸片，1R g/片，检测MRS平板应置于35℃ （而不是37℃）孵育24h （而不是16〜18h）。
结果判断：金黄色葡萄球菌：S：三13mm；I：11〜12mm；R:W10mm。
凝固酶阴性葡萄球菌：S：三18mm；R W17mm。
对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。
2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6R g/ml苯唑西林+4%NaCl,调整菌液浓度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。
（二）MRS监测意义对于MRS,应报告对所有头抱菌素类和其他B -内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10〜23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。
二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头抱菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。
2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。
药敏纸片：庆大霉素：120R g/片；链霉素300p g/片结果判断：R：W6mm；I：7~9mm；S：三10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：三500R g/ml；链霉素：R：2000p g/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30p g/片，检测平皿置35℃24h （而不是16〜18h）,并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。
鹑鸡肠球菌对万古霉素耐药性监测及耐药基因研究
Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ
ＸＩＥ Ｈｕｉ， ＺＨＯＵ Ｗａｎ⁃ｑｉｎｇ， ＳＨＥＮ Ｈａｎ
μｍｏｌ ／ Ｌ） 各 １ μＬ， ｄｄＨ ２ Ｏ ６ μＬ。 ＰＣＲ 反 应 条 件：
９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，５４ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，共 ３０
个循环；７２ ℃ ７ ｍｉｎ。 ＰＣＲ 产物经 １５ ｇ ／ Ｌ 琼脂糖凝
依据。
胶电泳，阳性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回
２０１９ 年 １－１２ 月南京大学医学院附属鼓楼医院临床分离 １５ 株鹑鸡肠球菌进行药敏试验，采用 Ｅ⁃ｔｅｓｔ 法复核菌株对万古霉素最
低抑菌浓度（ ＭＩＣ） ；采用 ＰＣＲ 及测序技术分析万古霉素耐药决定基因 ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ１ 及 ｖａｎＣ２ ／ ３；采用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００
测序技术对菌株基因组 ＤＮＡ 进行双端测序（ ＰＥ） ，利用生物信息学对菌株全基因组序列分析及耐药基因、毒力基因分析。
结果 １５ 株鹑鸡肠球菌对万古霉素的 ＭＩＣ 值集中在 ４ ｍｇ ／ Ｌ 和 ８ ｍｇ ／ Ｌ，所占比例分别为 ４０％和 ３３ ３％，检出 １ 株（ ６％） 万古
霉素高水平耐药株 ＥＧ１７９０６（ ＭＩＣ 为 ２５６ ｍｇ ／ Ｌ） ，该菌株除对万古霉素和替考拉宁耐药外，对其余常用抗生素均敏感；１５ 株菌
外药敏试验可呈现低水平耐药或敏感结果，但不建
议临床使用。 目前，已有对万古霉素高水平耐药鹑
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ｈｙｌ．Ｔｈｅ
ｐｒｅｓｅｎｃｅ
ｏｆ ｅｓｐ ｉｎ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ・ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｃｏｃｃｕｓ Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｅｕｓ ｗａｓ
ａ
ｆａｅｃｉｕｍ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｎｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
１３２
塞旦匡堂苤查垫！垒生箜！Ｑ鲞箜！塑
・检验与临床・
耐万古霉素肠球菌的耐药与毒力基因检测
杨靖娴
摘要
刘静邵冬华
王树琴孙娜
吴富炜
梁国威
目的：调查万古霉素耐药基因和５种毒力基因在临床分离肠球茵中的分布特点，探讨万古霉素
耐药与毒力因子之间的相关性。方法：Ｅ—ｔｅｓｔ法检测１２２株肠球茵对万古霉素和替考拉宁的最低抑菌浓度 （ＭＩＣ）。多重ＰＣＲ法检测ｖａｎＡ、ｖａｎＢ及粪、屎肠球菌的菌种特异基因，同样采用多重ＰＣＲ法检测常见毒力基 因ｅｓｐ，ｈｙｌ、ｇｅｌＥ、ａｓａｌ以及ｃｙｌＡ在上述肠球菌中的分布。结果：共检出７６株万古霉素耐药肠球菌（ＶＲＥ）（屎 肠球菌６９株，粪肠球菌７株）和４６株万古霉素敏感肠球菌（ＶＳＥ）（屎肠球茵２８株，粪肠球菌１８株）；所有 ＶＲＥ耐药表型与基因型一致，属ｖａｎＡ型：粪肠球菌毒力基因检出率明显高于屎肠球菌，并表现为多基因携 带；屎肠球菌仅ｅｓｐ和ｈｖｌ阳性。屎肠球菌ＶＲＥ的ｅｓｐ携带率显著高于其ＶＳＥ。结论：我院肠球菌耐药问题严 重，ｅｓｐ基因分布最广泛，且与万古霉素耐药显著相关。加强肠球菌耐药与毒力基因的监测有利于为预防和 控制耐药茵的流行与传播提供重要的基础信息。 关键词肠球菌属： 万古霉素；毒力
均≥２５６ Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ；对替考拉宁呈现不同水平耐药。
见毒力基因ｅｓｐ、ｈｙｌ、ｇｅｌＥ、ａｓａｌ以及ｃｙｌＡ，了解并
万方数据
实崩医学杂志２０１４年第３０卷第１期
ＭＩＣ介于１２—２５６
Ｉ－Ｌｇ／ｍＬ。
经多重ＰＣＲ检测．７６株ＶＲＥ均为ｖａｎＡ基因
Ｇｕｏ—ｗｅｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｈａｎｇｔｉａｕ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
１０００４９，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＬＩＡ ＮＧ Ｇｕｏ—ｗｅｉ Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｇｗ７２１＠１６３．ｃｏｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ
Ｔｏ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ
ｔｏ
ｆｉｖｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ
ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ・
ｔｏ
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ，ａｎｄ
菌株确认和ＶＲＥ筛选全部菌株复苏后经 ｃｏｍｐａｃｔ全自动微生物分析仪重新鉴定，质
Ｉｘｇ／ｍＬ
．６８８ ｂｐ ｃｙｌＡ ｔ５１０ ｂｐ ｅｓｐ ・３７５
控菌株为粪肠球菌ＡＴＣＣ２９２１２。采用含６
万古霉素的脑心浸液筛选平皿筛选ＶＲＥ，点种５ 汕ｌ浓度为０．５麦氏浊度的菌液，３５。Ｃ孵育２４ ｈ，有 菌落生长者为ＶＲＥ。万古霉素敏感菌株对照为粪 肠球菌ＡＴＣＣ２９２１２，万古霉素耐药菌株对照为粪
对万古霉素和替考拉宁的最低抑菌浓度（ｍｉｎｉｍｕｍ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ），药敏判断标准参照
ｅｓｐ、ｈｙｌ、ｇｅｌＥ、ａｓａｌ以及ｃｙｌＡ基因的多重ＰＣＲ产物电 泳检测结果
２０１２ＣＬＳＩ—Ｍ１００一￥２２文件［６｜。
１．３－３细菌ＤＮＡ提取挑取血平板上经纯培养后 的菌落适量，置人装有２００斗Ｌ去离子水的１．５
ｍｉｎ；３０
个循环（变性：９４℃１ ｍｉｎ；退火：５４℃１ ｍｉｎ；延
ｍｉｎ。
采用多重ＰＣＲ法［ｓ］检测常
肠球菌２８株，粪肠球菌１８株）。全部菌株分布于不 同科室，包括老年病科、神经内科、呼吸科、心内科、 肾内科、血液科和普外科。 ２．２药物敏感表型和耐药基因检测分析Ｅ—ｔｅｓｔ 结果显示，７６株ＶＲＥ对万古霉素高度耐药，ＭＩＣ
ｓｅｒｉｏｕｓ
ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ
ｏｕｒ
ｈｏｓｐｉｔａｌ．Ｅｓｐ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｇｅｎｅ ａｍｏｎｇ ｆｉｖｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ，ｉｔ ｈａｄ
ａ
ｗｉｔｈ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ＶＲＥ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｔｒａｉｔｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
（Ｂｉｏ．ｒａｄ公司）。 １．３方法
１．３．１ Ｖｉｔ的分布频率及特征。各基因引物及反应 体系同原文献［５］，ＰＣＲ反应条件同上述耐药基因检 测条件。根据各基因片段大小不同进行结果判断 （图１），５种ＰＣＲ产物均经双向测序证实为目的条
带。
ＹＡＮＧ Ｊｉｎｇ－ｘｉａｎ，ＬＩＵ Ｊｉｎｇ，
Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ ＳＨＡＯ Ｄｏｎｇ－ｈｕａ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ—ｑｉｎ，ＳＵＮ Ｎａ，ＷＵ Ｆｕ—ｗｅｉ，ＬＩＡＮＧ Ｃｅｎｔｅｒ
ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ
ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ
ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｔｗｅｎｔｙ—ｔｗｏ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ
ｏｆ ｔｈｅ
ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ ｂｙ Ｅ－ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ ｖａｎＡ，ｖａｎＢ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｅｎｔｅｒｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ａｎｄ Ｅｎｔｅｒｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｅｓｐ，ｈｙｌ，ｇｅｌＥ，ａｓａｌ ａｎｄ ｃｙｌＡ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｕｈｉｐｌｅｘ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
（屎肠球菌６９株，粪肠球菌７株）和４６株ＶＳＥ（屎
菌株情况经Ｖｉｔｅｋ
２
以及在基因水平上进行菌种鉴定，引物见表１，扩 增反应总体积为２５ ｔｘＬ．ｖａｎＡ、ｖａｎＢ基因引物各０．２
ｉｘＭ，ｄｄｌ．ｅｆａ、ｄｄｌ．ｅｆｍ基因引物各０．４“Ｍ，ＤＮＡ模板 １．５¨Ｌ。扩增反应条件为：预变性，９４℃３ 伸：７２℃１ ｍｉｎ）；延伸，７２℃５ １．３．５毒力基因检测
统计学意义。
２结果
２．１
２０℃保存备用。
１．３．４耐药基因检测
ｖａｎＡ、ｖａｎＢ及粪肠球菌和屎肠球菌特异的ｄｄｌ基因
片段（ｄｄｌ—ｅｆａ、ｄｄｌ—ｅｆｍ），能同时检测菌株耐药基因
ｃｏｍｐａｃｔ微生物分析仪 和菌种特异性基因双重鉴定后．共收集到１２２株肠 球菌，其中粪肠球菌２５（２０．５％）株，屎肠球菌９７ （７９．５％）株。经ＶＲＥ筛选确认后．获得７６株ＶＲＥ
万方数据
塞旦医堂苤查垫！垒堡箜！Ｑ鲞箜！塑
１３３
１材料与方法
１．１
表１粪、屎肠球菌耐药基因及菌种特异性基因引物
基因名称引物名称 序列 片段长度（ｂｐ）
菌株来源７６株ＶＲＥ和４６株ＶＳＥ均来自
２０１１年７月至２０１３年７月期间航天中心医院检 验科微生物室鉴定冷冻保存菌株．标本来源为尿 液、血液、胸水和腹水。全部菌株均为患者首次入院
肠球菌ＡＴＣＣ５１２９９。 １．３．２药物敏感性检测 采用Ｅ—ｔｅｓｔ法检测ＶＲＥ
ｈ㈣ａ１
－２Ｉ ３ ｂｐ ｇｅｌＥ
注：Ｍ，１００ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ；１，ｅｓｐ；２，ｈｙｌ；３，ｇｅｌＥ；４，ａｓａｌ；５，ｃｙｌＡ、
ｅｓｐ和ａｓａＩ共同阳性；６，ｅｓｐ、ｇｅｌＥ、ａｓａｌ和ｅｙｌＡ共同阳性；０，阴性 对照 图１
近年来．肠球菌已逐渐成为院内感染的重要病 原菌．临床感染以粪肠球菌和屎肠球菌多见。万古
霉素耐药肠球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ．ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ，
菌表面蛋白（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｓｐ）、透 明质酸酶（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ｈｙｌ）、明胶酶（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ， ｇｅｌＥ）、聚集物质（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ａｓａｌ）和溶 细胞素（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ，ｃｙｌＡ）［５２。 本研究收集了２０１１年７月至２０１３年７月期 间航天中心医院检出的１２２株肠球菌，包括７６例 ＶＲＥ和４６例万古霉素敏感肠球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ— ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ．ＶＳＥ），采用多重ＰＣＲ法分别 进行耐药基因和毒力基因的检测，旨在了解我院 ＶＲＥ的耐药基因型，以及上述５种毒力基因在我 院的分布情况，并对ＶＲＥ与ＶＳＥ的致病性进行比 较．探索耐药与毒力因子之间的相关性，为临床预 防和控制肠球菌的流行与传播提供重要依据。
２０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｍＬ
１．４统计学处理采用统计软件ＳＰＳＳ １１．０进行 分析。两组间率的比较采用卡方检验，多组间率的
比较采用ＲｘＣ列联表卡方检验．Ｐ＜０．０５为差异有
离心管中，混匀。１００℃水浴１０ ｍｉｎ，迅速４℃冷却 ｒｐｍ离心５ ｍｉｎ，取上清液作模板，一 采用多重ＰＣＲ法［７一ｓ］检测
ｓｕｒｆａｃｅ
ＶＲＥ）的出现和迅速增多更是成为全球公共卫生
的重要威胁［・剖。又有报道［４ｌ指出，ＶＲＥ在欧洲正常
人肠道的定植率高于美国，但其感染率却远低于美 国．提示肠球菌感染率的上升不仅是因为耐药性的 增多，可能还与其致病性增强有关。目前，研究较多 并认为与肠球菌致病性相关的因子主要包括肠球