膜片钳技术资料汇编

丁香园膜片钳技术讨论区资料汇编整理人：xiaoxuanzi发起人：tianx7752006年6月目录第一节膜片钳技术介绍 (1)应用 (1)基本概念 (2)第二节仪器操作和维护 (3)仪器的使用 (3)噪声 (4)玻璃微电极的制备 (5)第三节 实验操作 (7)1.细胞的分离、培养 (7)(1)心肌细胞 (7)(2)平滑肌细胞 (17)(3)其他细胞 (19)2.电极的拉制与电镀 (23)3.电极内外液与渗透压 (25)4.串联、封接、电极电阻 (28)5.补偿 (37)6.刺激方案 (40)7.动作电位记录 (42)8.电流记录 (42)(1)钙电流 (42)(2)钾电流 (45)(3)钠电流 (47)(4)其他电流 (48)9.穿孔 (50)10.单通道记录 (51)11.脑片 (54)12.数据分析与处理 (55)第四节 相关电子文献及书籍 (61)第一节 膜片钳技术介绍一、应用1.全细胞记录技术的应用[Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等)（2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。

（3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。

（4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。

（5）组织切片的全细胞记录。

(6)植物细胞的电生理研究。

二、基本概念1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊holding potential与command potential？Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？都分别什么时候给予？在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节扭？[baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验模式。

而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激方案，比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV，然后去极化至+10mV 400ms，那么这个去极化至+10mV的方波就是commandvoltage，当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。

Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的，通过外接刺激器来施加command voltage，当然现在完全由计算机代替了。

pipette capacity是电极电容，因为时间常数小，所以称快电容，而Cm是膜电容，因为时间常数大，所以称为慢电容。

Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节扭，那是对电极电容的补偿方式。

实际上电极电容中也有一些时间常数较大的成分，单纯补偿FAST效果并不完美，需要再稍稍调节一下SLOW。

2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。

离子通道一般有备用关闭状态（close），激活状态（active）和失活状态（inavtive）。

但最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是一个概念，但又找不到确切的含义，有谁能帮我解释一下这几种通道状态个代表什么含义？[coolworm]C<----->O<------->I这里，C: 关闭O：开放I：失活激活(activation：从C到O的过程。

失活(inavtivation)：从O到I的过程。

去激活(deactivation)：I 回到C的过程。

3.请问，有没有人知道，电压钳和电流钳的区别，电流钳的英文是不是current-clamp?多谢！[xuji007] 电压钳应该就是钳制住电压来测电流，电流钳就是钳制住电流来测电压。

电流钳就是current-clamp。

4.请教整流的定义，以及内向整流、外向整流的区别，我只知整流是一种电学特性，并且成为诸如钾通道分类的标准，但对上述确切含义还很模糊，请高手赐教！[xuji007]我不是高手，只是谈谈自己的理解。

如果膜只是一个单纯的电阻的话，那么通过它的电流就应该和电压是线性的关系。

但由于通道的存在，这种线性关系就会被改变。

比如Ik1,它的电流随电压增大的趋势会随着电压的增大而逐渐减弱，也就是内向整流了。

还请高手之指正。

[dingyinyuan]所谓整流一般是相对离子通道电流的电压依赖性的线性关系而言，内向整流指离子通道电流随电压的升高而降低，I-V曲线位于相对偏向下。

如心肌细胞IK1 。

外向整流指离子通道电流随电压的升高而更高超过电压依赖性的线性关系电流值，I-V曲线位于相对偏向上。

[心潮澎湃]依据欧姆定律：R=U/I，若U增大，但是I不是按比例增大，即为整流。

若U增大，I增大的幅度减小，I-V曲线向下弯曲，则为内向整流，如IK1的部分外向电流，反之，如U增大，I增大的幅度增加，I-V曲线向上弯曲，则为外向整流，如ITO电流，整流与除极和复极有一定联系。

[baxiansheng]rectifying “整流”，是借用物理电子学的一个概念，大家都知道“整流二极管”，在一个方向电阻非常小，反向电阻非常大。

在通道电流中，是指这种通道的电流在一个方向上的电导（电阻的倒数）大，而反方向的电导小。

比如内向整流钾电流，是指电流内流时电导较小，外流时电导较大，在I-V曲线上不呈直线，而是零电流以上的部分斜率下降，呈抛物线状，亦及电导G＝I/V变小（在通道电生理中，一般外向电流为正）。

在钾通道中，很多电流具有整流特性，比如乙酰胆碱敏感钾电流，ATP敏感电流等等。

delayed rectifying k+ channel 延迟整流钾通道，是特指的一种钾电流通道，在豚鼠上有表达，而在大鼠上几乎没有。

它具有整流的特性。

而且这个通道只具有激活们而没有失活门，当去极化激活后，电流不会象钠电流、钙电流、瞬时外向钾电流等随时间延长又自动失活，这大概就是它delayed的含义。

这个电流含有快成分和慢成分两种。

不知这样解释是否明白。

第二节 仪器操作和维护一、仪器的使用1．各位高手，本实验室刚买的一套设备， 膜片钳放大器是Axopatch 200B，采集卡是 digitizer 1200 ，软件是Axon公司的Pclamp 8.0，请问各位有没有使用相似设备的，能把你们放大器和采集卡interface的线路连接告诉我吗？还有，我们的微操纵器是***的液压的，那个架子是怎么安装到显微镜上面去的？[chianhuu]其实那么多接口，用到的并不多。

信号线是使用BNC线将放大器的scaled output连接信号器的 ANALOG IN 任意接口，这是采集信号。

将 放大器的 COMMAND INPUT（任意,分别对应于面板上两个旋钮，根据需要连接）连接信号器的 ANALOG OUT 1或2 。

HEADSTAGE 接电极HEAD。

最好能将放大器上的SIGNAL GROUND 和整台机器的公共接地端连接，抗干扰。

放大器连接电脑的接口用DIGITAL BOARD 。

其他的就不用了。

2．我看了几个单位的PATCH ,他们都没有要外加的刺激器和示波器.仅有PATCH CLAMP(AXONPATCH200和A/D(1322A)转换卡.我们想PATCH CLAMP 里有方波刺激,电脑显示屏能代替示波器.于是我们也参照他们的线路联接.结果就是不能正常地测电阻.谁能告诉我们AXONPATCH200B和A/D1322转换器正确的连接线路吗?1, 由PATCH CLAMP 和A/D组成的如何连接2. 由PATCH CLAMP 和A/D以及示波器组成的连线.[yangk2002](1)，要不要刺激器，取决于实验设计。

如果只需要通过电极细胞内刺激，当然不需要刺激器。

而如果需要在细胞外产生刺激（例如刺激突触前递质分泌），则非用不可；(2)示波器显示变化比电脑快，有的实验室还用。

这是各人习惯问题，有人说用示波器“太土”，是一种不了解情况的说法；(3)接线方法有二：彻底搞清法（费时，但对今后有好处）：仔细对照软件使用指南，上面有详细说明；囫囵吞枣法（省事，立即可用）：照猫画虎，看别人的连接方法，然后拷贝别人的程序，保证可以运行。

是为抛砖引玉。

3．膜片钳采集软件Clampex的Acquisition Mode中Fixed-Length Events Mode和Variable-Length Events Mode是如何采样的？他们有何区别？主要用于那种实验？[刘振伟]Fixed-Length Events Mode用于诱发突触活动、动作电位等时间长度固定的信号采集。

在设定阈值的情况下，对阈上事件进行采样，对每个阈上事件的记录时间长度是固定的，但总的采集时间被记录下来。

记录也可受控于外部触发命令。

Variable-Length Events Mode用于通道关闭时间较长（静止期较长）的单通道记录。

在设定阈值的情况下，只对阈上事件进行采样，而对没有阈上事件发生的“静止期”则不采样，从而减小了所记录数据文件的容量。

4．请问,各位,我们用的200Ｂ的放大器，为什么总是超载呢？是软件设置的问题，还是硬件的问题（急）谢谢[upboom]我用的也是200B，以前我也碰到过overload的情况，提供几个方面的原因供你参考：(1)保证电极拉制质量，没有断头、过粗现象。

(2)holder和参比电极的银丝要镀得均匀，时间过久则需要重新镀银。

(3)接地良好。

(4)细胞外液、电极内液配制合理，渗透压、PH保证在正常范围内，并用滤膜过滤去除杂质细菌。

(5)入水后适当调节液接电位（我的offset值就调在4～5之间），如果是这方面原因，那么肯定会恢复正常的。

二、噪声1.我们用的是ＣＥＺ-2400型膜片钳放大器(NIHON KOHDENO,Japen)放大,是血细胞做的，接地还可以，以前他们一直是这么做的，可是我放大以后才发现干扰电流幅度在2~6pA左右，基本把我作出的电流淹没了。

[sbboy1973]你要首先确定你的G欧封接是否成功？依我个人经验电极电阻一般在7－10较合适，等你G欧封接成功后噪声会大大降低；2，滤波要打在1KHz，不要太高；3，放大一般在20－50倍即可，但还要根据你测定的通道电流大小决定；4，要大大降低噪声，还是要很好的接地、很好的屏蔽（最要注意的是显微镜）、最好在晚上做，其中屏蔽尤其要注意那些电线、插头，可以用排除法慢慢试，要有耐心。