色谱基础原理 20171212

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色谱原型装置
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色谱方法的发展历史
1935年 离子交换柱色谱法 1941年 液液分配柱色谱法 1944年 纸色谱法 1952年 气相色谱法 1956年 薄层色谱法 1959年 凝胶柱色谱法
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1968年前后 高效液相色谱法 1975年 离子色谱法 80年代初 超临界流体色谱法 80年代中后期 毛细管电泳法 90年代后期 毛细管电色谱法 目前 手性分离色谱、高分辨 色谱、多维色谱
标准脱气机（G1322A).
标准脱气机每个通道体积为12ml 建议排液操作：5ml/min 排液6min以上。
微脱气机（G1379A).
微脱每个通道体积为1ml 建议排液操作：2ml/min 排液5min。 切勿用5ml/min 流速去排液。
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Agilent 1100 在线脱气机
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Agilent 1100 在线脱气机日常维护,故障诊断
检查溶剂过滤器 －拧开脱气机出口或比例阀入口管线，并使液面高于出口30cm此时溶剂会因为重力流出，脱气机或溶剂过 滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出。 －查看过滤器是否变色． －临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常． 清洁溶剂过滤器
（2）分配色谱法：用液体做固定相，根据不同组分在固定相（液体）和流动相 之间分配系数的不同进行分离。如气液色谱法、液液色谱法。
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4、按色谱过程的分离机制分类
（3）离子交换色谱法：固定相是离子交换剂，依据离子型化合物中各离子组分 与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别进行分离。
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1、按流动相和固定相的状态分类
流动相 固定相 类型
液体
液体 气体 气体 超临界流体
固体
液体 固体 液体
液-固色谱 液相色谱 (1) LC 液-液色谱
气-固色谱 气相色谱 (2) GC 气-液色谱
超临界流体色谱 (3)
SFC
随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表 面，这种采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱法 (4)
组分在固定相中的质量 mS k 组分在流动相中的质量 mM
分配比也称：容量因子(capacity factor)和容量比(capacity radio)； 1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离 柱温度、柱压的改变而变化。 2. 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该 组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。
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2、按固定相的操作形式分类
按照管柱的粗细和 固定相的填充方式 固定相装在管柱内 柱色谱 毛细管柱色谱
填充柱色谱
薄层色谱
平面色谱 固定相呈平面状 按平面材料的不同
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纸色谱 高分子薄膜色谱
3、色谱法的简单分类
填充柱色谱法
气相色谱法
毛细管柱色谱法
经典液相柱色谱法 高效液相色谱法
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Agilent 1100 在线脱气机
何时需要使用Agilent 1100在线脱气机
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Agilent 1100 在线脱气机-在线脱气机 (G1322A/G1379A)
脱气机的操作：
操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30ml，对微脱气机10ml）冲洗 真空脱气机，特别是 当泵关闭了一段时间后（如过夜），以及在通道中使用挥发性混合溶剂时。
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
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（2）速率理论
色谱兴起之后，科学家们在实际研究中发现得到的色谱峰往往是展宽的图 形，塔板理论无法解释这种现象。为此，荷兰学者Van Deemter等人于1956年 提出了速率理论。该理论吸收了塔板理论中理论塔板高度的概念，并同时考虑 影响理论塔板高度的动力学因素（涡流扩散、分子扩散、传质阻力、载气流速
等 ），研究色谱分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响，对色谱分离条件的
选择具有指导意义。
速率理论为色谱法的实践提供了理论指导，同时为高效液相色谱法的创建
提供了启迪和依据。
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色谱理论：速率理论-影响柱效的因素
1. 速率方程（也称范· 弟姆特方程式）
H = A + B/u + C· u H：理论塔板高度， u：载气的线速率(cm/s)。 减小A、B、C三项可提高柱效。 存在着最佳流速。
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（1）塔板理论
色谱发展初期，Martin等人借助分馏中的塔板概念，把色谱柱设想为由许多 塔板组成的分馏塔，把色谱分离过程比拟作分馏过程，提出了表达柱效能模式
的塔板理论。
L
ΔV 0 1 2 3 4 5
H
色谱柱
L:色谱柱柱长; H: 理论塔板高度; ΔV：样品体积
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色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标
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色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为
n=L/H 色谱峰的方差 与柱长或保留时间的关系为：
H
2 L
L

t2 L
2 tR
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
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速率理论的要点：
(1) 组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩 散、传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等是造成色谱峰扩展柱 效下降的主要原因。
(2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高 柱效。
(3) 为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对 柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约：载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱 效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利 于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最 高。
影响分离因子的因素
• 固定相类型
两个组分分离峰 增加分离因子 α 增加柱效 N
• 固定相生产商- 不同品牌的相同固定相，也 有很大的选择性差别 • pH值
• 流动相-甲醇，乙腈，THF以及不同比例的 混合物。
增加容量因子 κ
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分配系数( partition coefficient) K
使用Agilent 1100 在线脱气机须知
溶剂
用棕色玻璃瓶装水溶液，可以避免藻类的生长。 过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。
避免使用下述可腐蚀钢铁的 溶剂：
碱金属卤化物及其酸溶液(如：碘化锂、氯化钾等)。 高浓度无机酸，如硝酸、硫酸. 可能含有过氧化物的色谱纯醚(如THF、二氧六环、二丙基乙醚)。这些在 使用前 必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物。 含强络合剂的溶液(如EDTA，乙二胺四乙酸)。 四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液。
柱色谱法 色谱法 液相色谱法
薄层色谱法 平面色谱法
纸色谱法 高分子薄膜色谱法
超临界流体色谱法
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4、按色谱过程的分离机制分类
吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 尺寸排阻色谱法
亲和色谱法
生物色谱法
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4、按色谱过程的分离机制分类
（1） 吸附色谱法：用固体吸附剂作固定相，根据样品中不同组分在吸附剂上 的物理吸附性能的差异进行分离。如气固色谱法、液固色谱法。
色谱法的起源
1906年由俄国植物学家Tswett创立
研究植物叶子的组成时，他将植物色素的石油 醚浸取液通过填充有碳酸钙的直立玻璃管，再用纯 净的石油醚自上而下淋洗，随着淋洗的进行，发现 不同色素向下移动的速度不同，最后色素中各组分 互相分离，形成不同颜色的谱带。
石油醚
流动相
碳酸钙
固定相
玻璃管
色谱柱
谱带
组分在固定相和流动相间发生的吸附、解吸，或溶解、挥发的过程叫 做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位： g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：
组分在固定相中的浓度 cS K 组分在流动相中的浓度 cM
分配系数是色谱分离的依据。
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分配系数 K 的讨论：
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Agilent 1100 在线脱气机日常维护,故障诊断
防止堵塞溶剂过滤器及真空腔 污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵的运行。这在水溶剂或磷酸盐 缓冲液 (pH 4 至 7) 中尤其如此。下 列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。
（6）生物色谱法：采用各种具有生物活性的材料（例如：酶、载体蛋白、细胞膜、 活细胞等）作固定相，利用固定相与各种生物活性物质的选择性结合进行分离。
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常用的液相色谱技术
反相 色谱
HILIC
正相 色谱
SFC
离子 色谱
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影响色谱分离度的因素
对于色谱而言，影响分离度的三个因素中，分离因子最为重要。
（4）尺寸排阻色谱法：又叫凝胶色谱法或空间排阻色谱法，用多孔性凝胶作固
定相，根据不同大小的组分分子在多孔性凝胶中的选择性渗透进行分离。
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4、按色谱过程的分离机制分类
（5）亲和色谱法：以在不同基体上键合多种不同特征的配体作固定相（称固定化分 子），根据不同组分与固定相的高专属性亲和力进行分离。
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