第六章重组体的筛选与鉴定总结
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重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是一种重要的生物技术手段，它可以用于改良微生物、植物和动物的基因组，从而实现对目标基因的精准编辑和调控。
在进行重组体的筛选过程中，选择合适的筛选方法对于提高筛选效率和准确性具有重要意义。
本文将介绍几种常见的重组体筛选方法，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 抗生素筛选法。
抗生素筛选法是重组体筛选中最常用的方法之一。
通过将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，能够通过对抗生素的耐受性来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法简单易行，且操作方便，适用于微生物和植物等生物体的筛选。
2. 标记基因筛选法。
标记基因筛选法是利用标记基因与目标基因共转化至宿主细胞中，通过标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
常用的标记基因包括荧光标记基因、抗性标记基因等，通过检测标记基因的表达情况，可以快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
3. PCR筛选法。
PCR筛选法是利用聚合酶链式反应（PCR）技术来筛选重组体。
通过设计特定的引物，可以扩增出含有目标基因的DNA片段，从而实现对重组体的筛选。
PCR筛选法具有高灵敏度和高特异性的优点，能够准确地检测出目标基因的存在，是一种常用的重组体筛选方法。
4. 免疫筛选法。
免疫筛选法是利用抗体对目标蛋白的特异性识别来筛选重组体。
通过将目标蛋白与标记蛋白连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用抗体对标记蛋白的特异性识别来筛选出含有目标蛋白的重组体细胞。
这种方法对于筛选蛋白重组体具有重要意义，能够快速准确地筛选出目标蛋白的重组体细胞。
5. 酶标记筛选法。
酶标记筛选法是利用酶标记技术来筛选重组体。
通过将目标基因与酶标记基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用酶标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法操作简便，能够快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
总结。
重组体的筛选方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
重组体克隆的筛选和鉴定
抗性筛选
通过载体上的抗性基因，如Amp抗性 基因，对重组体克隆进行筛选，重组 的克隆具有抗性。
筛选流程
转化
将目的基因和载体DNA共转化到大肠杆菌中 。
克隆筛选
根据筛选方法，从转化子中筛选出重组体克 隆。
培养和扩增
将筛选出的重组体克隆进行培养和扩增，以 备后续鉴定。
筛选中的注意事项
避免假阳性
在筛选过程中要严格控制条件，避免出现假阳 性结果。
生物化学鉴定法
通过检测表达产物的生化性质， 如酶活性等，判断目的基因是否 成功表达。
鉴定流程
构建重组体克隆
将目的基因与载体DNA连接， 形成重组体克隆。
转化受体细胞
将重组体克隆导入受体细胞中 ，使目的基因在受体细胞中表 达。
筛选阳性克隆
通过抗性筛选、PCR鉴定等方 法筛选出含有目的基因的阳性 克隆。
生物信息学技术
通过生物信息学技术，可以对重组体克隆进行全面的分析和鉴定，包 括基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。
重组体克隆在其他领域的应用前景
生物制药
重组体克隆技术在生物制药领域具有广泛的应用前景，可用于生 产高纯度、高质量的药物。
生物能源
利用重组体克隆技术可以改良微生物，提高生物燃料的生产效率。
在生物制药领域的应用
药物靶点发现
01
通过筛选重组体克隆，可以发现新的药物靶点，为新药研发提
供基础。
药物作用机制研究
02
通过鉴定重组体克隆，可以深入了解药物的作用机制，为药物
优化提供依据。
药物筛选
03
利用重组体克隆进行高通量药物筛选，提高药物发现的效率。
在基因治疗领域的应用
基因功能研究
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
47
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
实验17-重组体筛选与鉴定
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是指通过DNA技术将来自不同来源的DNA片段重组而构建的新的DNA 分子。
重组体技术被广泛应用于基因工程、遗传学研究和生产实践中。
重组体的筛选是确保所需目标DNA片段被正确重组的关键步骤。
以下是几种常用的重组体筛选方法。
1. 纤维素酶切筛选法纤维素酶切筛选法是一种原理简单、操作方便的筛选方法。
通过将重组体与纤维素酶一起处理，纤维素酶能够选择性地降解未重组的DNA片段，而保留重组体。
重组体可通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用DNA杂交技术来确认重组体的存在。
2. 改性PCR筛选法PCR（聚合酶链式反应）是一种能够在体外扩增特定DNA片段的技术。
在重组体筛选中，可以通过设计特定引物，使得PCR只能扩增包含目标DNA片段的重组体，而无法扩增未重组的DNA片段。
PCR扩增后，可以使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，确认是否存在所需目标DNA片段。
3. 限制性内切酶和DNA连接酶筛选法限制性内切酶是能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
在重组体筛选中，如果所需目标DNA片段被正确重组，限制性内切酶将无法切割形成的DNA链，而能够切割未重组的DNA片段。
通过对重组体和未重组DNA使用相应的限制性内切酶进行酶切反应，可以通过琼脂糖凝胶电泳分离并观察DNA片段的断裂情况，确定重组体的存在。
4. 荧光标记筛选法荧光标记筛选法利用荧光染料标记目标DNA片段，通过荧光检测的方式进行筛选。
一种常用的方法是将重组体的目标DNA片段与荧光基团结合，形成荧光标记的重组体。
然后，通过荧光检测技术，如荧光凝胶电泳、荧光显微镜观察等，可以检测到荧光信号，确认重组体的存在。
此外，还有其他一些筛选方法，如互补性DNA杂交、DNA测序、南方印迹、北方印迹等，可以根据具体实验需要选择合适的方法进行重组体的筛选。
总结起来，重组体的筛选方法多种多样，可以根据实验的目的和具体条件选择适合的方法。
需要注意的是，在筛选过程中，实验者需要仔细操作，严格控制实验条件，以确保筛选结果的准确性和可靠性。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
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① 同源序列的分析： 阅读框架的分析：
一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有 翻译起始信号和终止信号等。
②无任何同源性的新序列(进行基因功能性研究的方法) 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据
表型推测基因作用；
用噬菌体显现（phage display）技术； 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。
第六章 重组体的筛选与鉴定
将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种 方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组 DNA的转化子是基因工程的目的所在.
➢ 何谓转化子?
所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标 志的细菌细胞或其他受体细胞.
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA 分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转 化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会 有以下几种情况发生:
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
1.以pBR322质粒为例
（2）筛选重组体的原理
在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用， 都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活， 于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或 Amprtets的表型。
当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或 SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr Tets ），重 组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌 先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌 落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在 Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必 定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.
用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水 平，检测mRNA的存在。
第三节 物理检测法 重组质粒的快速提取与酶切鉴定
经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行 鉴定，酶切鉴定是最常用的方法之一。
通过提取“阳性克隆”的质粒，酶切分析“阳性 克隆”中质粒的大小和酶切图谱，通过这种方法鉴定 载体中是否含有外源DNA片段，载体中是否含有正确的 目的DNA片段。这种方法判断的标准是目的DNA分子和 载体的分子大小及酶切图谱。
间接 筛选
• 翻译产物(Western blot) • 转录产物(Norther blot) • 其他方法(报告基因)
第一节 遗传学检测法 一、根据载体表型特征的筛选
根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是 一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使 用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常 有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、 四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr） 根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重 组体DNA分子必不可少的条件之一。
⑵. 核酸分子杂交： ①.Southern杂交分析：由英
国Southern（1975）发明，将琼 脂糖中DNA转移到尼龙膜进行 DNA分子杂交分析的方法。
筛选基因库得到阳性克隆 将限制性酶酶切与Southern杂交 结合绘制限制性酶图谱。
②.Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和 程序相同。
在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的 β-半乳糖苷酶片段都没有活性。
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3. 举例 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白
质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入 到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改 变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒 的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因 此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质 粒与自身环化的载体DNA分开。
3:空载体EcoRⅠ酶切;4-10:为不同”阳性克隆”质粒的EcoRⅠ酶切分 析;
此外，还有其他方法， 如：Wester 杂交分析、核酸序列分析、 免疫化学检测法等
③.Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。
⑶. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 采用Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸
➢ 常用的重组子筛选和鉴定方法
直接 筛选
重组 子的 筛选
DNA 鉴定
• 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) • 重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段
大小鉴定)
• DNA序列分析 • 同源性分析鉴定(原位杂交)
载体 筛选
• 质粒载体的抗性标记筛选 • 噬菌体包装容量的正性筛选 • 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) • 标记补救筛选
β-半 乳糖苷 透过酶
β-半乳糖 苷乙酰基 转移酶
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检
测功能.
应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基 因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过 大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜 色变化鉴别出重组子和非重组子。
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果
插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选.
(二)举例
当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插 入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重 组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来. 而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋 白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控 制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这 样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了 体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带 有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体 的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选， 所以又称为平板筛选法。
•载体和一个或数个串联目的基因连接 •载体发生自连 •目的DNA分子发生自连 •未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的 重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿 主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有 正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细 胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方 案并加以验证。
AmprTetr
AmprTets
菌落原位影印
Amp琼脂平板
Tet琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选
（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
1.乳糖操纵子的结构
RNA聚 合酶
PI lacI PZYA lacO lacZ lacY lacA
mRNA
mRNA
阻遏蛋白
β-半乳 糖苷酶
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。
1.以pBR322质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有
一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 位点。
终止法测定核酸序列。
在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：
⑷. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为
基因、有什么功能，需用计 算机软件或生物学实验进一 步分析。 ①.同源序列的分析： 同源性比较：
将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的 同源性，将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比 较。
第二节 核酸分子杂交检测法 一、菌落印迹原位杂交
将噬菌体感染形成的噬菌斑 影印在硝酸纤维膜上变性 带 有目的基因的放射性DNA或cDNA 作探针进行杂交放射性自显 影 杂交信号（黑点）对应的 噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的 筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝 酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进 行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用 两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规 的检测手段。
从图中可看出:4、5泳道为不含插入片段的空载体；6、9泳道虽然含 有外源DNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所 以为假阳性；7、8、10泳道和2泳道的电泳图谱相同（除空载体对应的条 带外），所以是阳性克隆。
Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
酶
切
鉴
定
克
隆
图
Mr:DNA分子Marker;1:目的DNA片段;2:目的DNA片段EcoRⅠ酶切;
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3.举例 pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控
序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这 个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位 点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。
大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的 编码信息。
同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也