羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定
猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定
猪 软 骨 Ⅱ型 胶 原 蛋 白的提 取 纯 化 与 鉴 定
姜 旭 淦 ，陈盛 霞 ，丁建 霞 ，王卉 放 ， 马 洁 ，吴 亮 ， 化 溪 许
（ 苏 大学 医学 技 术 学 院 ． 苏 镇 江 ２ ２０ ） 江 江 １０ １
［ 摘
要 】 目的 ： 从猪关节软骨 中提取纯化 Ⅱ型胶 原蛋白 ， 并对其进行鉴定 。方法 ： 选择猪关节软骨 为提取 原料 ， 用
Ｓ ｕ ｙ ｏ ｓ ｌ ｔｏ ｔ ｄ ｎ ｉｏａ ｉ ｎ，ｐｕ ｉ ｃ ｔｏ ａ ｄ ｉ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｒｆ ａ ｉｎ ｎ ｄｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｉ ｉ
ｏ ｏｌｇ ｎ ｔｐ Ｉ ｆｏ ｐ ｒ ｉｅ ａ ｔ ｕａ ａ ｉ ｇ ｆ ｌ ｅ ｅ ｌ ｒ ｍ ｏ ｃｎ ｒｉ ｌｒｃ ｒ ｌ ｅ ｃ ａ ｙ ｃ ｔ ａ
Ｐ Ｅ．ａ ｓ ｒ ｔ ｎ ｓ ｅ ｔ ｍ ａ ｄ ａ ｎ ｃｄ ａ ａｙ ｉ． Ｒｅ ｕ ｔ ：ｒ ｅ ｐ ｏｅ ｇ ｙ ａ ｓ ｃ ｕ ｄ ｂ ｆ ｃ ｅ ｔ ｅ ＡＧ ｂ ｏ ｐ ｉ ｐ ｃｒ ｍｉ ｏ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｕ ｎ ｌ ｓ ｓｌ ｓ Ｉ ｒｔ ｏ ｌｃ ｎ ｏ ｌ ｅ ｅ ｉｎ ｌ ｒ — １ ｈ ｉ ｙ
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第 ｌ ６卷第 ５期
２０ ０６年 １ ０月
江 苏 大 学 学 报（ 学 版） 医
Ｊｕ ａ ｏ ｉ ｇｕ Ｕ ｉ ｒ ｔ（ ｅｉｉ ｄｔｎ ｏｒ ｌ ｆＪ ｎｓ ｎｖ ｓｙ Ｍ ｄｃ ｅＥ ｉｏ ） ｎ ａ ｅｉ ｎ ｉ
猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定
［ Abstract］ Objective：To isoIate and purify coIIagen type !（ C!）from porcine articuIar cartiIage and identify its purity. Methods：The porcine articuIar cartiIage was seIected as raw materiaI. Guanidine hydrochIoride was used to remove the proteogIycans. The digestion of pepsin，saIting of sodium chIoride，treatment with DE22 ceIIuIose were studied for extracting C !. The purity identification was made by SDS PAGE，absorption spectrum and amino acid anaIysis. Results：The proteogIycans couId be efficientIy removed by 4 moI / L guanidine hydrochIoride. The better resuIts were obtained by Iimited enzyme digestion of pepsin added by two steps. The optimizing concentration of sodium chIoride for saIting C! was 2. 4 moI / L. It was found that the bands of purified C!and Sigma C! were at the same Iocation by SDS - PAGE. The absorption peak was at 230 nm. The concentrations of GLY，PRO and ALA were highest by amino acid anaIysis. Conclusion：The resuIts suggest that the C! isoIated from porcine articuIar cartiIage has high purity and accords with the characteristics of coIIagen type !. The improved method we adopted has significant advantages such as simpIe working process，convenient source of raw materiaI and resuIt reIiabiIity. ［ Key words］ coIIagen type !；rheumatoid arthritis；cartiIage；proteogIycan
鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定
鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定目的探讨可溶性Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)的提纯方法。
方法以雏鸡胸软骨为原材料,酸性条件下经胃蛋白酶消化,离心后,应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,透析,盐析,得到纯化的CⅡ。
结果自提的CⅡ样品与CⅡ标准品采用SDS-PAGE电泳显示条带一致。
结论本法提纯CⅡ具有材料丰富,操作简便,重复性好等优点。
标签：Ⅱ型胶原蛋白提取纯化胶原蛋白是结缔组织的重要成分之一,分20余种,其中CⅡ主要存在于软骨基质,占软骨干重的一半以上,研究表明类风湿关节炎(RA)的发病与CⅡ的自身免疫反应有关,国内外均于口服CⅡ诱导免疫耐受治疗RA的相关报道[1～3],该方法有可能成为安全、简便、有效的新型治疗方法。
因此,CⅡ的提纯是我们研究此方法的重要前提,目前国内外文献的报道中多采用盐酸胍来粗提胶原蛋白[4～5],盐酸胍是一种蛋白质变性剂且有一定的毒性,如果在提纯的过程中不能被完全清除,在一定程度上会限制CⅡ的临床应用。
本试验参照Trentham[6]及Miller[7]等方法,用胃蛋白酶法提取,操作简便,重复性好,且提取的CⅡ安全性大。
1临床资料1.1一般资料鸡胸软骨:取材于孵化场17d的雏鸡。
CⅡ:Sigma公司(来源于鸡),5mg/瓶。
1.2主要仪器离心机(日立高速冷冻离心机);层析柜(LKB2023,BROMMA minicoldlab)。
1.3主要试剂胃蛋白酶(Sigma 5g/瓶);DEAE-Sephadex A 50(Amersham);Tris(sigma 100g/瓶)。
1.4CⅡ的粗提将新鲜干净的鸡胸软骨捣碎成糊状,用缓冲液和蒸馏水分别洗涤2遍,然后将其悬浮于0.5mol/L的醋酸中(调pH为2.5),加入胃蛋白酶,4℃下消化72h,低温离心,取上清液-20℃保存。
沉淀物再次悬浮于0.5mol/L醋酸中,同样条件下胃蛋白酶重复消化,离心2次。
将3次上清液混匀,用pH7.6,0.05mol/L Tris-Hcl,0.2mol/LNaCl 溶液充分透析。
羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定
， 离心得到上清液和沉淀 Ａ 。调 Ｎ 浓度 Ｌ ４ ℃盐析过夜， １ ａ Ｃ ｌ （ ， 透析袋（ 德国 Ｓ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ ３ ２上海试剂二厂） ｅ ｒ ｃ ａ Ｆ ｅ ｉ ｎ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｃ ａ 至 ４ｍ 离心得到上清液和沉淀 Ａ 。 ｏ ｌ ／ Ｌ时， ４ ℃ 盐析过夜， ２ 公司） ， 余试剂均为国产分析纯。 取沉淀 Ａ 用０ １ ． １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ乙酸溶解， ２ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＮ ａ Ｏ Ｈ中和至 ｐ Ｈ １ ． ２ 主要仪器 公司） ； 凝胶全自动图像分析系统 电泳仪（ Ｂ ｉ ｏ －Ｒ ａ ｄ 公司） ； 冷冻离心机（ 日立公司 Ｃ ） ； 酸度计 （ Ｂ ｉ ｏ －Ｒ ａ Ｆ １ ６ Ｒ Ｘ （ 梅特勒 －托利多仪器有限公司） ； 电子天平（ 梅特勒 －托利 型冷冻干燥机（ ） 。 Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ Ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｎＣ ｏ ｒ ｐ ｏ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ １ ． ３ 方法 １ ． ３ ． １ 胶原蛋白的提取 从新鲜的羊肋软骨中切取透明 ， 分别再用 ０ （ ） 、 蒸馏水进行 ７ ． ４ ． ０ ５ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＴ ｒ ｉ ｓ －Ｈ Ｃ ｌ ｐ Ｈ７ ． ４ 透析平衡后， 即得胶原初提液 Ｓ 。 １ ） 的预处理 １ ． ３ ． ２ 阴离子交换树脂（ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ ３ ２ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ－３ ２ 经过溶胀、 酸处理、 碱处理后， 用去离子水平衡至中性， 处理 １ ． ３ ． ３ 蛋白批量离子交换 将蛋白初提液 Ｓ 和３ 倍体积 １
收稿日期： ２ ０ ０ ９ － ０ ５ － １ ４ 基金项目： 宁夏回族自治区教育厅资助项目（ ） ； 宁夏回族自 ２ ０ ０ ７ ４ ９ 治区科技攻关资助项目（ 年） ２ ０ ０ ９ 作者简介： 肖旭 （ ， 男， 河北人， 在读硕士研究生， 从事生化 １ ９ ８ ２ －） 药理学研究工作。 通信作者： 高岭 （ ， 女， 研究员， 硕士生导师， 从事生化药理 １ ９ ５ ８ －） 学研究工作。 Ｅ－ｍ ： ａ ｉ ｌ ｇ ｌ ＠ｎ ｘ ｍ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
可溶性Ⅱ型胶原蛋白提取纯化条件的研究
万方数据临床检验杂志２００６年第２４卷第６期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，２００６，Ｖ０１．２４，Ｎｏ．６４１９上述沉淀用０．１ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶解，２ｍｏｌ／ＬＮａｏＨ中和至ｐＨ７．５，用０．０５ｍｏｌ／Ｌｒｉｆｆｓ－ＨＣＩ－Ｏ．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（ｐＨ７．５）进行透析平衡后，即得胶原初提液。
按比例，向胶原初提液中加入ＤＥ２２纤维素或ＤＥＡＥ－琼脂糖，４℃下搅拌２ｈ，１２０００Ｘｇ离心２０ｍｉｎ。
上清液经盐析、酸溶、对水透析脱盐、冷冻干燥，即得纯化的ＳＣＣＩＩ。
１．５ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测ｏ¨主要条件如下：浓缩胶浓度３％（ｐＨ６．８）．，分离胶浓度７．５％（ｐＨ８．８），采用Ｔｒｉｓ．甘氨酸不连续分离系统，电泳电压１００～１２０Ｖ。
电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝染色３ｈ，脱色后用数码照相和ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ全自动图像分析系统进行图像分析。
１．６吸收光谱检测用岛津分光光度计在波长１８０ｎｍ～５００ｎｍ范围进行扫描，条件如下：纸速８０ｍｍ／ｍｉｎ，扫描速度２００ｎｍ／ｍｉｎｏ１．７氨基酸成分分析委托南京大学医药生物技术国家重点实验室检测。
１．７．１酸水解将提取的ｃⅡ置水解管中，加入５．７ｍｏｌ／ＬＨＣｌ（内含１％苯酚）充Ｎ２，封管１１０ｏｃ水解２４ｈ，中和定容离心后，进行氨基酸分析。
１．７．２碱水解将提取的ＣⅡ用５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ水解，进行色氨酸（Ｔｒｙ）测定。
２结果；．１１Ｉ型胶原提取与纯化胶原初提液各组分的电泳图谱见图１；Ｐ４－１经ＤＥ２２纤维素和ＤＥＡＥ－琼脂糖纯化的ＳＣＣＩＩ，其电泳图谱见图２。
２．１．１鸡胸箭突软骨成分分析ｓ１的电泳图谱显示，鸡胸箭突软骨含有４种蛋白成分，除ＣⅡ外，其他３种成分分子量较小，分子量在３００００左右。
ｃＩＩ：Ｓｉｇｍａ鸡Ⅱ型胶原蛋白。
其余见文中１．４所述。
图１ＩＩ型胶原初提液各组分的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱２．１．２盐酸胍去除蛋白多糖的效果由图１可见，除Ｐ５．１、Ｐ５－２外，其他步骤成分未见非ＣⅡ成分。
胶原蛋白测定实验报告
一、实验目的1. 掌握胶原蛋白的提取和纯化方法；2. 学习利用分光光度法测定胶原蛋白含量；3. 掌握胶原蛋白分子量的测定方法。
二、实验原理胶原蛋白是一种生物大分子，广泛存在于动物的皮肤、骨骼、肌腱等组织中。
本实验采用酸水解法提取胶原蛋白，通过分光光度法测定其含量，并利用SDS-PAGE法测定胶原蛋白的分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：猪皮、硫酸、无水乙醇、丙酮、邻苯二甲醛（OPA）、双缩脲试剂等；2. 仪器：分析天平、恒温水浴锅、离心机、紫外可见分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 胶原蛋白提取与纯化（1）取猪皮，剪成小块，用剪刀剪成粉末；（2）将猪皮粉末加入适量的硫酸，于100℃恒温水浴锅中水解2小时；（3）将水解液冷却至室温，加入无水乙醇沉淀蛋白质，离心分离；（4）将沉淀物用丙酮洗涤，再次离心分离；（5）将沉淀物溶于适量的双缩脲试剂中，得到胶原蛋白溶液。
2. 胶原蛋白含量测定（1）配制双缩脲试剂，按比例配制A液和B液；（2）取适量的胶原蛋白溶液，加入A液，室温放置10分钟；（3）加入B液，摇匀，室温放置10分钟；（4）用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定吸光度；（5）根据标准曲线计算胶原蛋白含量。
3. 胶原蛋白分子量测定（1）配制SDS-PAGE凝胶；（2）将胶原蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳；（3）将电泳后的凝胶进行染色；（4）利用凝胶成像系统观察并记录电泳结果；（5）根据标准分子量蛋白质条带，计算胶原蛋白的分子量。
五、实验结果与分析1. 胶原蛋白含量测定通过分光光度法测定，得到胶原蛋白溶液的吸光度为0.635，根据标准曲线计算得到胶原蛋白含量为0.15mg/mL。
2. 胶原蛋白分子量测定通过SDS-PAGE电泳，得到胶原蛋白条带，与标准分子量蛋白质条带对比，确定胶原蛋白分子量为15000Da。
六、实验结论本实验成功提取了猪皮中的胶原蛋白，并通过分光光度法和SDS-PAGE法测定了胶原蛋白的含量和分子量。
Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途[发明专利]
![Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/25f25276b207e87101f69e3143323968001cf456.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911392203.9(22)申请日 2019.12.30(71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号院申请人 得利斯集团有限公司(72)发明人 张春晖 郭玉杰 李侠 王航 黄峰 郑乾坤 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙) 11369代理人 卞静静(51)Int.Cl.C07K 14/78(2006.01)C12P 21/06(2006.01)C07K 1/14(2006.01)(54)发明名称Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途(57)摘要本发明公开了Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，包括：步骤一、将软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液混合，用功率为900～1000W的超声波处理24～36分钟；步骤二、将步骤一得到的混合液离心，取上清液；步骤三、调节上清液的pH为7，然后加入氯化钠进行盐析并收集蛋白沉淀；步骤四、将步骤三得到的蛋白沉淀用醋酸溶液溶解，然后用蒸馏水透析。
本发明还提供了Ⅱ型胶原蛋白的用途。
相比于现有技术，本发明的方法大幅度提升了Ⅱ型胶原蛋白的纯度和产率，得到的Ⅱ型胶原蛋白结构完整，并具有较好的热稳定性和高发泡性及乳化性，在食品、医药、化妆品等行业具有良好的应用前景。
权利要求书1页 说明书10页 附图4页CN 111004320 A 2020.04.14C N 111004320A1.Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括：步骤一、将软骨、胃蛋白酶、醋酸溶液混合，用功率为900～1000W的超声波处理24～36分钟；步骤二、将步骤一得到的混合液离心，取上清液；步骤三、调节上清液的pH为7，然后加入氯化钠进行盐析并收集蛋白沉淀；步骤四、将步骤三得到的蛋白沉淀用醋酸溶液溶解，然后用蒸馏水透析。
2.如权利要求1所述的Ⅱ型胶原蛋白的提取方法，其特征在于，在步骤一之前，还包括：步骤a、将软骨切碎，置入氯化钠溶液内，搅拌，洗去油脂和气泡；步骤b、依次加入碳酸钠溶液、乙二胺四乙酸二钠溶液，并且间隔一段时间更换溶剂；步骤c、用蒸馏水洗涤步骤b得到的软骨，至洗涤后的蒸馏水的pH为7。
Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化和鉴定
研究简报文章编号:1000-2790(2002)19-1820-02I型胶原蛋白的提取纯化和鉴定王彦宏朱平冷南解慧(第四军医大学西京医院临床免疫科陕西西安710033)关键词:I型胶原蛋白;胃蛋白酶;关节炎中图号:R593.22文献标识码:B1材料和方法1.1材料胃蛋白酶及I型胶原蛋白(C I)标准品购自美国Sigma公司.M r14.4~97.4>103低分子标准蛋白购自上海丽珠东风生化技术有限公司.CS-9000薄层扫描仪购自日本岛津公司.1:Protein marker;2:C I(Sigma)2g L-1;3:C I(Sigma)1gL-1;4:C I1g L-1;5:C I0.5g L-1;6:C I0.25g L-1; 7:0.125g L-1.图1SDS-PAGE分析经DEAE-52纤维素柱层析纯化的C I1.2方法新鲜牛软骨剥去骨膜在液氮冷冻下磨成粉称质量用10倍体积的4mol L-1盐酸胍-0.05mmol L-1Tris-~Cl(p~7.5)混悬后于4 下搅拌24h12000g离心20min弃上清用0.5mmol L-1乙酸充分洗涤.沉淀用4倍的0.5mmol L-1乙酸(内含1g L-1胃蛋白酶)混悬 4 下搅拌48h20000g离心20min取上清然后用3mmolL-1的NaCl沉淀过夜离心沉淀用0.1mmol L-1乙酸溶解此即为粗制之I型胶原蛋白(C I).DE52离子交换柱经0.05mmol L-1Tris-~Cl-0.2mmol L-1NaCl(p~7.4)平衡后装入高度为20cm体积为120mL的交换柱内.缓缓加入经平衡液透析后之粗制C I在核酸蛋白检测仪检测下(7=280nm)调节流速约5mL min-1收集第1峰(C I)然后用3mmol L-1收稿日期:2001-12-04;修回日期:2002-03-24基金项目:国家新药基金资助项目(96-901-05-262)通讯作者:朱平.Tel.(029)3375355Email.Zhuping 作者简介:王彦宏(1963-)男(汉族)陕西省扶风县人.主管技师. Tel.(029)3375360Email.cxyhfk NaCl4 下沉淀过夜离心取沉淀用0.5mmol L-1乙酸重溶解.透析此即为纯化后之C I.C I的鉴定:D采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电永(PAGE).选用50g L-1浓缩胶和120g L-1分离胶样品分别为低分子标准蛋白(M r为97.4 66.2 43.0 31.0 20.1和14.4>103)标准C I及不同批次的自产纯化C I.按常规电泳;@凝胶采用CS-9000薄层扫描仪扫描7=580nm.2结果C I的SDS-PAGE的条带经与C I对照品(Sigma 公司产品)和标准分子蛋白的条带对照均一致(图1).SDS-PAGE薄层扫描结果如图2.图2薄层扫描分析SDS-PAGE凝胶3讨论I型胶原是RA的一种自身抗原抗胶原抗体和胶原特异性T细胞在关节炎的发生和发展中起重要作用[1-3]口服同种属或异种属I型胶原均有抑制减轻动物模型关节炎和人类RA的作用[4 5]国外多采用鸡I型胶原鉴于牛软骨来源更丰富我们采用胃蛋白酶消化法从牛软骨提取C I并经DEAE-52离子交换柱层析纯化SDS-PAGE和薄层扫描鉴定均表明获得与Sigma公司产品分子质量一致的C I为临床应用提供了实验方法和便利条件.参考文献:[1]Snomden N Reynlds I Morgan K~olLt.T cell responses to~uman type I collagen in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls[J].1997;40(7):1210-1218.[2]Myers LK~iggins GC Finkel T~Reed AM Thompson JWWalton RC~endrickson J Kerr NC Pandya-Lipman RK Shlopov BV Stastny P Postlethwaite AE Kang A~.Juvenile arthritis and autoimmunity to type I collagen[J].2001;44(8):1775-1781.[3]Garnero P Gineyts E Christgau S Finck B Delmas PD.Association of baseline levels of urinary glucosyl-galactosyl-pyridinoline and type I collagen C-telopeptide With progression of joint destruction in patecnts With early rheumatoid arthritis [J].th t s Rheum,Z OOZ;46(1):Z1-3O.[4]Schulze-Koops~,Kalden JR.The balance of Th1/Th Zcytokines in rheumatoid arthritis[J].Best P act Res Cl n Rheumatol,Z OO1;15(5):677-691.[5]Christgau S,Garnero P,Fledelius C,Moniz C,Ensig M,Gineyts E,Rosenguist C,Gvist P.collagen type I C-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation[J].Bone,Z OO1;Z9(3):Z O9-Z15.编辑许福明技术方法文章编号:1OOO-Z79O(Z OOZ)19-18Z1-O1六节通络仪治疗原发性高血压46例张青,傅卫红,沙建平,唱荣艳(解放军第451医院惠宾病房,陕西西安71OO54)关键词:传统医学;经络;高血压中图号:R544.1文献标识码:A0引言高血压是严重危害人类健康的疾病之一,药物治疗存在一定的副作用和局限性,因此,非药物治疗近年来受到较为普遍的重视,为探索有效的非药物治疗方法,我们采用六节通络仪对原发性高血压进行治疗,并进行对照研究.1对象和方法1.1对象符合1999年世界卫生组织和国际血压联盟(W~0/IS~)制定的高血压诊断及分级标准的门诊或住院原发性高血压患者86(男5O,女36)例,其中I级高血压4O例, I级高血压46例.全部患者经1Wk药物冲洗期后随机分为六节通络仪治疗组45例,年龄(6Z 8)岁;对照组41例,年龄(61 7)岁,两组年龄,性别,血压等特征无差异(P>O.O5). 1.Z方法治疗组采用秦原金纶医疗仪器厂生产的六节通络仪,根据循经取穴,正负交替的原则,选择手足阳明经穴,足太阳经穴及督脉,任脉穴为主腧穴,双侧同时治疗,每次1h,1次d-1,14d.对照组口服硝苯地平缓释片(成都药业有限责任公司生产)1O mg,Z次d-Z.两组治疗期间停用其他影响血压的药物,观察治疗前后血压,心率,并记录治疗反应及不良作用.测量血压前休息5min,由专人使用同一血压计测量右侧上肢肱动脉血压,连续测量3次,间隔Z min,取平均值.取疗程结束前3d记录结果平均值与治疗前作比较,按(舒张压+1/3脉压)求得平均动脉压(MBP).疗效标准:显效-舒张压下降大于等于1.33kPa并降至正常或下降Z.67kPa以上;有效-舒张压下降小于1.33kPa 但降至正常或下降1.33~Z.66kPa;无效-未达上述标准.统计学处理:血压测量结果用I s表示,组间t检验,有效率比较用X Z检验.2结果治疗组和对照组治疗后收缩压~舒张压~平均动脉压均明显下降,心率改变不明显(表1).治疗组总有效率91.1%(41/45),显效率4Z.Z%(19/45),有效率48.9%(Z Z/ 45);对照组总有效率9Z.7%(38/41),显效率43.9%(18/ 41),有效率48.8%(Z O/41).两组有效率无差异(P>O.O5).六节通络仪治疗组治疗期间无不良反应,对照组不良反应为面色潮红3例,头痛Z例,心悸1例,对症处理后能耐受治疗.表1两组治疗前后血压及心率的变化(kPa,I s)组别收缩压舒张压平均动脉压心率(次min-1)治疗组(n=45)治疗前Z1.O9 Z.Z41Z.6O 1.4116.6O 1.6775.3 1O.5治疗后17.6O 1.39b1O.O9 O.75b11.88 1.O9b7O.5 8.Z b对照组(n=41)治疗前Z O.83 Z.O81Z.69 1.O116.OO 1.4473.6 14.Z 治疗后17.5Z 1.Z7b1O.88 O.87b11.79 1.36b8O.4 7.5bb P<O.O1U s治疗前.3讨论高血压属中医学~头痛,~眩晕等范畴,其发病机制与肝阳上亢,肝肾阴虚,阴阳失衡密切相关[1].大量临床实践证明,针刺疗法对高血压有较好的疗效,针刺与高血压相关的经络,可产生经络本身所具有的传导感应,纠正阴阳失衡,偏盛偏衰所致的高血压病的虚实证候,达到补虚泄实,恢复人体阴阳平衡的作用,使血压下降[Z].有研究表明,针刺可调节自发性高血压大鼠的中枢和外周去甲肾上腺素~多巴胺和5-~T的含量,调节脑内和外周交感神经系统的活动,使外周血管阻力下降,降低血压[3].针刺具有滋阴潜阳~平肝熄风~宁心安神作用的穴位,不仅能较快的改善头痛~眩晕等高血压症状,还能调节神经系统,改善心肌代谢,解除外周血管痉挛,降低外周阻力,从而使血压下降.但传统体针及灸法痛苦较大,患者不易坚持治疗,六节通络仪采用现代电子技术,遵循大调合的基本原理,通过调频发射多种适合人体的电子脉冲,对穴位无创作用,腹背要穴同时治疗,一些禁针禁灸的穴位亦可选收稿日期:Z OOZ-O5-Z Z;修回日期:Z OOZ-O6-Z3作者简介:张青(196O-),女(汉族),上海市人.副主任医师,科主任.Tel.(OZ9)Z Z31884Ext.571用[4],且具有降压作用平稳,患者依从性好的特点,其降压效果与口服硝苯地平缓释片无明显差异,而且无服药所常见的头痛,面色潮红等副作用,对老年患者,长期高血压已产生耐受的患者更为适用,但其作用机制及长期效果尚有待进一步研究.参考文献:[1]皱碧云,颜红红.活血熄风汤配合尼群地平治疗原发性高血压病64例临床观察[J].新中医,Z OO1;33(1O):38-39.[Z]孙洪如,谢英彪,徐立群,王天宇.高血压病的自然疗法[M].南京:江苏科学技术出版社,1999:16O-19O.[3]周逸平,王月兰,方志斌.针刺对S~R血压及N E,D A,5-~T含量的影响和血压与血粘度的关系[J].针刺研究,1995;Z O(3):55 -57.[4]张青,傅卫红,沙建萍,高炳趁,邓雅莉,唱荣艳.六节通络仪治疗脑血管病偏瘫36例[J].第四军医大学学报,Z OO1;Z Z(15):14Z9.编辑许昌泰Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化和鉴定作者：王彦宏， 朱平， 冷南， 解慧作者单位：第四军医大学西京医院临床免疫科,陕西,西安,710033刊名：第四军医大学学报英文刊名：JOURNAL OF THE FOURTH MILITARY MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：2002,23(19)被引用次数：5次1.Schulze-Koops H;Kalden JR The balance of Th1/Th2 cytokines in rheumatoid arthritis[外文期刊]2001(05)2.Garnero P;Gineyts E;Christgau S;Finck B,Delmas PD Association of baseline levels of urinary glucosyl-galactosyl-pyridinoline and type Ⅱ collagen C-telopeptide with progression of joint destruction in patecnts with early rheumatoid arthritis[外文期刊] 2002(01)3.Myers LK;Higgins GC;Finkel TH;Reed AM,Thompson JW,Walton RC,Hendrickson J,Kerr NC,Pandya-Lipman RK,Shlopov BV,Stastny P,Postlethwaite AE,Kang AH Juvenile arthritis and autoimmunity to type Ⅱcollagen 2001(08)4.Christgau S;Garnero P;Fledelius C;Moniz C,Ensig M,Gineyts E,Rosenquist C,Qvist P collagen type ⅡC-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation[外文期刊] 2001(03)5.Snomden N;Reynlds I;Morgan K;HolLt T cell responses to Human type Ⅱ collagen in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls 1997(07)1.张志胜.刘安军.刘媛.菅景影.ZHANG Zhi-sheng.LIU An-jun.LIU Yuan.JIAN Jing-ying口服羊软骨Ⅱ型胶原蛋白抑制小鼠佐剂性关节炎研究[期刊论文]-河北农业大学学报2006,29(5)2.刘小康.方治平.肖逸.蒋维.王浴生.LIU Xiao-kang.FANG Zhi-Ping.XIAO Yi.JIANG Wei.WANG Yu-sheng鸡Ⅱ型胶原蛋白的药物动力学研究[期刊论文]-华西药学杂志2001,16(2)3.许海.徐玉东.刘兰涛.陈国荣.钟淑琦.马月秋口服Ⅱ型胶原蛋白对佐剂性关节炎大鼠白细胞介素1-β表达的影响[期刊论文]-哈尔滨医科大学学报2007,41(5)4.刘媛.王健.王永刚.张志胜.LIU Yuan.WANG Jian.WANG Yong-gang.ZHANG Zhi-sheng羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯工艺[期刊论文]-食品研究与开发2009,30(11)5.钱娴娟.胡永秀.赵文明用FPLC系统提纯可溶型Ⅱ型胶原蛋白[期刊论文]-免疫学杂志2001,17(3)6.王彦宏.朱平.冷南.韩捷.解慧离子交换色谱一步法纯化Ⅱ型胶原蛋白[期刊论文]-细胞与分子免疫学杂志2000,16(6)7.姜旭淦.朱敏娟.葛彦文.吴亮.陈盛霞.许化溪.JIANG Xu-gan.ZHU Min-juan.GE Yan-wen.WU Liang.CHEN Sheng-xia.XU Hua-xiⅡ型胶原蛋白抗血清的制备和检测[期刊论文]-江苏大学学报(医学版)2008,18(1)8.姜旭淦.陈盛霞.丁建霞.王卉放.马洁.吴亮.许化溪.JIANG Xu-gan.CHEN Sheng-xia.Ding Jian-xia.WANG Hui-fang.Ma Jie.WU Liang.XU Hua-xi猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定[期刊论文]-江苏大学学报（医学版）2006,16(5)9.姜旭淦.陈盛霞.王卉放.吴亮.许化溪.JIANG Xugan.CHEN Shengxia.WANG Huifang.WU Liang.XU Huaxi可溶性Ⅱ型胶原蛋白提取纯化条件的研究[期刊论文]-临床检验杂志2006,24(6)10.卫晋雄.赵怡芳.程珺.朔敬人唾液腺腺样囊性癌细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的研究[期刊论文]-中国口腔颌面外科杂志2003,1(2)1.宁志刚.王富友.崔运利.熊娟.杨柳可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定[期刊论文]-重庆医学 2011(10)2.沈杰.鲍建芳.何东仪.张之澧.倪立青乌梢蛇Ⅱ型胶原提取及其诱导大鼠关节炎特性的研究[期刊论文]-现代免疫学 2007(3)3.姜旭淦.陈盛霞.王卉放.吴亮.许化溪可溶性Ⅱ型胶原蛋白提取纯化条件的研究[期刊论文]-临床检验杂志2006(6)4.姜旭淦.陈盛霞.丁建霞.王卉放.马洁.吴亮.许化溪猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定[期刊论文]-江苏大学学报（医学版） 2006(5)5.郭云.张景锡.彭必先各类型胶原的分离方法[期刊论文]-明胶科学与技术 2005(3)本文链接：/Periodical_dsjydxxb_4200219031.aspx。
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羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定作者：肖旭，石文达，姚青，陈虎，王基云，李晓兵，高岭【摘要】目的从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白，并对其进行鉴定。
方法选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后，用盐酸胍去除蛋白多糖，经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤，提取纯化蛋白，然后进行鉴定。
结果 4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意；氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳。
SDS-PAGE 电泳结果显示提取纯化的蛋白与Sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致。
Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212 nm。
结论从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高，且符合II型胶原蛋白的特征。
【关键词】Ⅱ型胶原蛋白；软骨；蛋白多糖Abstract: Objective To isolate and purify collagen type Ⅱ(CⅡ) from Sheep cartilage and to identify its purity. Methods The Sheep cartilages were collected as raw materials. After degreasing and decalcification, Guanidine hydrochloride was used to remove the proteoglycans. The digestion of pepsin, salting of sodium chloride were performed for extracting CⅡand identification. Results The proteoglycans could be efficiently removed by 4mol?L 1 guanidine hydrochloride. The results were obtained by limited enzyme digestion of pepsin added. The optimizing concentration of sodium chloride for salting CⅡwas 3mol?L 1. It was found that the protein and SigmaCⅡ were at the same location by SDS PAGE. The absorption peak was at 212nm. Conclusion The CⅡ isolated from Sheep cartilage has high purity and accords with the characteristics of Collagen typeⅡ.Key words: collagen typeⅡ; cartilage; proteoglycansⅡ型胶原蛋白(collagen typeⅡ，CⅡ)是软骨基质的主要有机成分，是关节软骨中主要的细胞外间质之一。
近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与CⅡ自身免疫反应有关［1-3］，口服CⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)有显著的疗效［4］。
对于胶原蛋白的提取目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在很大的差别［5-8］。
本研究选择宁夏富有的绵羯羊肋软骨为原料，来制备较高纯度的Ⅱ型胶原，报告如下。
1 实验材料和方法1. 1 主要试剂和耗材胃蛋白酶(Amresco 公司)；盐酸胍（Amresco 公司）；牛Ⅱ型胶原蛋白参照品(C7806 Sigma公司)；46～200 kD蛋白质分子量标志物(宝生物工程有限公司)，阴离子交换载体(DEAE32 上海试剂二厂)，透析袋（德国 Serca Feinbiochemica公司），余试剂均为国产分析纯。
1. 2 主要仪器电泳仪(Bio-Rad公司)；凝胶全自动图像分析系统(Bio-Ra公司)；冷冻离心机(日立公司 CF16RX)；酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；721分光光度计(Varian公司)；LL-3000型冷冻干燥机（Thermo Electron Corporation）。
1.3 方法1.3.1 胶原蛋白的提取从新鲜的羊肋软骨中切取透明软骨，剥去骨膜，去除骨化部分，用生理盐水洗净，切成0.5mm左右的薄片，液氮冷冻粉碎后称重，按照软骨量加入5倍体积的脱脂液(氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8)在4℃下搅拌脱脂48h，期间每8h更换脱脂液直到脱脂完全，在同样温度和搅拌条件下用10倍体积的0.lmol/L盐酸进行脱钙处理48h，直到软骨变柔软，离心去除脱钙液，按照每克软骨加入10倍体积的4mol/L盐酸胍，于4℃搅拌48h，12000g离心20 min，沉淀用Tris-HCl （pH7.4）缓冲液和0.5mol/L乙酸充分洗涤后，用5倍体积的胃蛋白酶消化液(0.5mol/L乙酸配成1g/L)混悬，4℃下搅拌24h，12000g离心30 min，收集上清液；沉淀再加5倍体积的胃蛋白酶消化液重复酶解一次，离心收集上清液。
混合两次上清液，用5 mol/L NaOH迅速调节上清液至pH 7.4。
加入氯化钠（NaCl）使其浓度为3 mol/L，4℃盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A1。
调NaCl浓度至4 mol/L时，4℃盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A2。
取沉淀A1用0.1mol/L乙酸溶解，2mol/L NaOH中和至pH 7.4，分别再用0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.4)、蒸馏水进行透析平衡后，即得胶原初提液S1。
1.3.2 阴离子交换树脂(DEAE32)的预处理DEAE-32经过溶胀、酸处理、碱处理后，用去离子水平衡至中性，处理好的离子交换载体置于4℃冰箱冷却备用。
1.3.3 蛋白批量离子交换将蛋白初提液S1和3倍体积的Tris-HCl（pH7.4）缓冲液混合后，置于烧杯中，加入适量用缓冲溶液平衡后的阴离子交换载体，使树脂和蛋白溶液的体积比约为1∶5，混合均匀，缓慢搅拌120min 后，12000g离心，收集上清液。
于上清液中加入氯化钠使其浓度为3 mol/L，4℃盐析过夜，12000g离心30min，收集沉淀。
将沉淀用0.1mol/L 乙酸溶解，分别再用0.05mol/L乙酸、0.01mol/L乙酸、蒸馏水进行透析平衡后，得胶原溶液，用冷冻干燥机冷冻干燥16h，收集蛋白冻干粉。
1.3.4 SDS-PAGE电泳检测将自提纯化的蛋白和牛Ⅱ型胶原蛋白参照品均配成0.01g/L 蛋白溶液。
浓缩胶浓度3% (pH 6. 8)，分离胶浓度8% (pH 8. 8)，电压140 V，电泳时间3h，结束后，凝胶用考马斯亮蓝染色30min，脱色后用凝胶全自动图像分析系统进行图像分析。
1.3.5 吸收光谱测定用分光光度计在波长180～500 nm范围进行扫描，扫描条件如下：纸速80mm/min，扫描速度180mm/min。
2 结果2.1 蛋白分子量的测定在盐析时，当NaCl浓度为3mol/L时，得到大量蛋白沉淀A1；当将NaCl浓度调至4mol/L时，得到的沉淀A2很少。
将沉淀A1和A2经过脱盐、透析处理后，进行SDS-PAGE电泳分析，电泳图谱见图1。
A1在电泳图谱上所表现与Sigma公司的牛Ⅱ型胶原蛋白参照品一致，分子量约为130 kD；A2为小分子蛋白主要在60-90 kD之间，见图1。
2.2 纤维素纯化的效果蛋白初提液S1经阴离子交换树脂(DEAE32)的处理后，进行SDS-PAGE电泳分析，与处理前比较未见明显变化，见图2。
2.3 提取的蛋白吸收光谱分析从图3可看出提取的蛋白吸收峰为212 nm，符合CⅡ的吸收光谱［9］。
3 讨论Ⅱ型胶原是RA的一种自身抗原，抗胶原抗体和胶原特异性T细胞在关节炎的发生和发展中起重要作用，口服同种属或异种属Ⅱ型胶原均有抑制、减轻动物模型关节炎的作用。
鉴于宁夏羊软骨来源丰富，我们采用酶消化法来提取羊Ⅱ型胶原蛋白。
图3 羊软骨Ⅱ型胶原蛋白吸收光谱Ⅱ型胶原分子间交联键的存在使其分子稳定性增加，这是胶原提取的主要困难。
本研究采用胃蛋白酶降解法，去除部分伸直端尾肽，螺旋结构不受影响，故仍保持Ⅱ型胶原分子完整性，抗原性基本不受影响。
由于关节软骨中含有大量的蛋白多糖，这些物质的存在直接影响纯化质量，盐酸胍溶解可有效去除大量的蛋白多糖，DEAE阴离子交换又进一步去除蛋白多糖［10-11］。
本实验结果提示4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖等杂质；并对NaCl为3mol/L时的离心沉淀用0.5mol/L乙酸溶解，再用DEAE32进行纯化，SDS-PAGE电泳未观察到处理前后的明显变化。
本研究对所提取的Ⅱ型胶原鉴定结果表明：①SDS-PAGE电泳与Sigma公司的样品完全一致，分子量约为130 kD。
②吸收光谱分析显示提取的蛋白紫外最大吸收峰在212 nm处，符合Ⅱ型胶原的特征。
所以此提取、纯化方法简单易行，并且可以工业化生产，为羊软骨CⅡ提取提供了实验方法和便利条件。
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