中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分对细菌内毒素的检验方法主要包括以下几个方面：
1. 细菌内毒素的生物学活性测定：采用小鼠、兔等动物模型，通过观察动物的反应和生存情况来评价细菌内毒素的生物学活性。
2. 免疫学方法：利用抗体与内毒素结合反应，通过免疫沉淀、凝胶免疫扩散、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析等方法来定量或定性检测细菌内毒素。
3. 生理检验：通过动物模型中的生理变化来判断细菌内毒素的存在与活性。
比如利用皮肤红斑反应、大鼠血压升高、家兔体温升高等指标。
4. 生化检验：采用染色反应、化学方法、酶活测定等手段来检测细菌内毒素的存在与活性。
比如利用抗原-抗体反应进行凝集、沉淀、免疫层析等实验。
以上这些方法都是中国药典第二部分中针对细菌内毒素的常用检验方法。
不同的方法适用于不同的细菌内毒素类型和浓度范围，综合运用可以提高检测的灵敏度和准确性。
无菌、内毒素检查法验证讲义1
无菌、内毒素检查法验证讲义1凝胶法和终点法采用单一的时间点采集结果数据，决定反应在规定的时间内是否达到预定的水平。
而动态法则是在适当的检测波长下监测整个反应过程的数据。
内毒素的浓度决定了蛋白凝胶形成的速率，因此，通过测量达到设定光密度的时间，确定光密度随时间的改变情况，以建立光密度变化的速率与参照内毒素之间的线性关系。
终点法中人为的加入反应终止剂，并且在此时间点读取和记录样品和标准曲线点的光密度，其缺点是：必须人为的终止反应，标准曲线的范围有限，仅为一个Log。
而在动态法中光度检测仪连续的读取光密度的变化，动态监测光密度的变化，记录达到设定的光密度所需要的时间。
动态法以将已知的标准内毒素浓度的对数与最终反应时间的对数作图，因此，测定范围可跨越4-5个Log（一般为0.005-50EU/ml），克服了终点法的缺点。
动态比浊法：凝胶的浊度形成是凝胶形成的前提，因此，在这个意义上浊度法其实是凝胶法的延伸。
进行浊度法的鲎试剂含有凝固蛋白原的量足以在凝固酶的作用下形成浊度，但不足以形成凝胶。
浊度法克服了凝胶法只能检测某一个限值水平的缺点，可以定量一定范围内的内毒素含量。
现在细菌内毒素定量法的使用率在国外已超过凝胶法，大约占65%～70%，并且还在逐年上升。
细菌内毒素检查方法的建立方法标准物质限值的确定干扰试验检验一、方法细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法凝胶法为限量测定方法，光度测定法为定量测定方法凝胶法分为限量试验和半定量试验；光度测定法包括动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法两种方法可任选一种进行内毒素的检测当测定结果有争议时，除有特殊规定外，以凝胶法结果为准二、标准物质除另有规定外，细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作对照品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品三、限值的确定 1、计算公式L=K/M 药品人用最大剂量参考《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》。
中国人均体重按60kg计算；人均体表面积按1.55m2计算。
中国药典 细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。
首先，制备试样溶液。
将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。
然后，制备标准溶液。
将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。
接下来，准备试管。
将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。
然后，进行混合。
轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。
接着，培养细菌。
将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。
培养结束后，观察结果。
通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。
最后，记录结果。
根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。
无菌微生物限度检查及方法验证
甘油冷冻管保藏法
• 将待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，培养 • 用无菌接种环轻轻刮取菌台，用接种环使细菌充分扩散到预先装于
试管中的无菌蒸馏水中 • 调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管 • 向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到
10%甘油菌悬液。 • 轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小试管。 • 制好的甘油冷冻管最好在-30℃条件下贮存。
•建立无菌室使用登记册
•使用日期，时间，使用人，设备运转状况，温、湿度，洁净度状况 （沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数），报修原因，报修结果，清洁 工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手），消毒液名称 等
微生物实验室的质量管理
实验室使用管理
1. 每天工作前用消毒液消毒工作台，开紫外灯（最少半小时）进行空气消 毒，每月定期做彻底清洁工作，适当时用消毒剂进行熏蒸。
• 将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为“一代”。
冷冻真空干燥保藏法
主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安 瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶型细致，不致损伤活 菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速 被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空 状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在 很长时间内菌种仍可维持活力不变。
•应定期更换消毒剂品种，按标准准确配制。
微生物实验室的质量管理
一、菌种的保存与管理
菌种名称：金黄色葡萄球菌
1. 菌种—特殊的标准品 应保持基生长特性和减少污染，是微生物实 验结果一致性的重要保证。
2. 制定菌种保藏管理制度
菌种系列号：[CMCC(B)26003]
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
中国药典2020无菌检查法
中国药典2020无菌检查法【原创版】目录1.概述2.检查法内容3.实施方法4.注意事项5.结论正文1.概述《中国药典 2020》是我国药品行业的权威标准，对药品的研发、生产、质量控制以及药品的审批上市等环节具有重要的指导意义。
其中，无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，它关乎到药品的安全性和有效性。
本文将对《中国药典 2020》中的无菌检查法进行详细解读。
2.检查法内容无菌检查法主要包括以下内容：（1）检查原理：通过检测样品中微生物的数量，判断样品是否符合无菌要求。
（2）检查方法：包括直接涂片法、薄膜过滤法等。
（3）检查标准：根据药品的类型和用途，规定了不同的无菌标准。
例如，注射剂要求无菌，而口服制剂则要求微生物限度符合标准。
3.实施方法在实施无菌检查时，需要遵循以下步骤：（1）样品的采集和处理：采集样品，进行适当的处理，如灭菌、稀释等，以保证检查结果的准确性。
（2）检查操作：根据选定的检查方法，进行无菌检查。
例如，直接涂片法是将样品涂抹在培养基上，观察培养基上是否有微生物生长；薄膜过滤法是将样品通过薄膜过滤器，然后将滤膜在培养基上进行培养，观察培养基上是否有微生物生长。
（3）结果判定：根据检查结果，判断样品是否符合无菌要求。
4.注意事项在进行无菌检查时，需要注意以下几点：（1）采样：采样应具有代表性，以保证检查结果的准确性。
（2）器具：检查过程中使用的器具应严格灭菌，防止外源性微生物的污染。
（3）环境：检查环境应符合无菌要求，避免环境中的微生物对检查结果的影响。
（4）结果判定：结果判定应严格按照标准进行，避免主观判断导致的误差。
5.结论无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，对保证药品的安全性和有效性具有重要意义。
《中国药典 2020》对无菌检查法进行了详细的规定，为药品企业和研究机构提供了明确的指导。
新版《中国药典》中关于无菌检查法的要点
一、概述新版《我国药典》是我国药品质量标准的权威参考书，对药品的生产、质量控制和使用起着重要的指导作用。
其中，无菌检查法作为一项关乎药品安全的重要检验方法，在新版《我国药典》中有着详细的规定和要求。
本文将针对新版《我国药典》中关于无菌检查法的要点进行分析和总结，以帮助广大药品生产企业和相关从业人员更好地遵循新版《我国药典》的要求，确保药品的质量和安全。
二、无菌检查法的定义和原理1. 无菌检查法是指通过一系列的操作和文化方法，检验药品制剂和原料是否受到微生物污染的方法。
其原理在于通过适当的培养基和环境条件，培养并鉴定出可能存在的微生物，从而判断药品的无菌性。
三、新版《我国药典》对无菌检查法的要求1. 无菌检查法的适用范围：新版《我国药典》详细规定了无菌检查法在药品制剂和原料中的适用范围，包括但不限于针剂、眼用制剂、无菌粉针剂等。
2. 无菌检查的方法和步骤：新版《我国药典》对无菌检查的方法和步骤做了具体的规定，包括样品处理、接种培养和培养条件等。
其中，对于各类制剂和原料的不同，还有相应的特殊处理和要求。
3. 无菌检查的检测指标：新版《我国药典》列出了无菌检查的检测指标，包括菌落总数、大肠杆菌、假单胞菌等。
对于不同的药品制剂和原料，还有相应的特殊微生物指标。
4. 无菌检查的结果判定：新版《我国药典》对无菌检查的结果判定做了明确的规定，包括阴性对照、阳性对照、样品处理和培养条件等。
针对不同情况下的结果判定，需要做出相应的处理和记录。
四、新版《我国药典》无菌检查法的实施和注意事项1. 实施要求：新版《我国药典》对无菌检查法的实施做了明确的要求，包括测试环境、培养基的选择、试验设备的保养和校准等。
对从业人员的要求也有相应的规定，包括岗前培训、操作规程和个人卫生等。
2. 质量控制：新版《我国药典》要求药品生产企业建立健全的质量控制体系，对无菌检查法的实施进行全程跟踪和记录。
并对不符合要求的样品做出相应的处理和报告。
中国药典2005版无菌检查和微生物限度检查 PPT课件
2、薄膜过滤法：取供试品10g，加至20ml十四烷酸异丙酯 （必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量），充分振摇，使供 试品溶解。然后加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓 冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取后，静置使油水明显分层， 取其水层为1：10的供试液
中国药典2005版无菌检查和微生 物限度检查方法的验证试验
中检所 特玉香
验证试验
一 、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性 二 、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对7株阳性对
照实验菌株的回收率逐一进行验证） 三 、菌种：枯草杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、 金
黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大 肠杆菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]、 白色念珠菌 (Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌 (Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(F) 10104]、生孢梭菌 Clostridum sporogens[CMCC(F) 6494]） 四 、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实验 五 、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3次 独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上
阳性对照菌计数结果表
药品微生物限度检查方法 验证试验记录
谢 谢！
3、取供试液1ml（相当于样品1g，1ml）注入开放式滤器， 用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后， 取出滤膜贴于规定的琼脂平板，置规定温度培养24-72小时， 逐日观察结果
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国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的 冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
中国药典无菌、微生物限度和细菌内 毒素检查方法学验证内容详解
主要内容
1、无菌检查方法学验证关键点及常见问题 2、微生物限度检查方法学验证关键点及常见问
题 3、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见问
题
无菌检查的方法学验证 相关规定 无菌检验证的关键点 验证中常见的问题
一、相关规定
药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药 典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品 微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行 近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药 品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和 严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要）
各药品检验所：
根据国食监注[2005]234号“关于颁布和执 行《中国药典》2005年版有关事宜的通知”规 定，《中国药典》7月1日起开始执行，各药 品检验所在执行“微生物限度检查法”和“无菌 检查法”过程中遇到了一些问题，为保证《中 国药典》2005年版的顺利实施，现就有关问 题说明如下：
1．“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安全性 检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均收载 有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”，但在如何 保证检验方法的科学性和检验结果的准确性方面与 国外药典相比仍具有一定差距，其关键是《中国药 典》未强调对检验方法进行必要的方法验证。为此， 药典会设立专项科研课题，对2005年版《中国药典》 的“微生物限度检查法”和“无菌检查法”增加验证试 验的必要性进行研讨。根据研究结果，2005年版 《中国药典》规定当进行药品的“微生物限度检查” 或“无菌检查”时应进行方法验证。
3．目前各药检所涉及的检验工作可分为三类： 注册检验（包括进口注册和新药注册）、监督 抽验和进口检验。考虑到各检验性质的差异， 各口岸所在进行进口复核及进口检验时，应请 企业提供方法验证材料或详细的SOP资料进行审 核；各口岸所完成复核时应在修订的进口注册 标准中明确“微生物限度检查”或“无菌检查”的关 键操作点（如供试品的处理方法等）及试验方 法（如平皿法、薄膜过滤法、直接接种法等）， 并在复核说明中概述验证实验结果，以方便以 后的进口检验。
验证的类型
●前验证: 建立药品的微生物限度检查法和无菌 检查法时（当建立药品的无菌或微生物限度检查 法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法 适合于该药品的无菌检查）。
● 再验证: 修订的检验方法;供试品的组分或原 检验条件发生改变可能影响检验结果时 ;定期的 方法验证（若药品的组分或原检验条件发生改变 时，检查方法应重新验证） 。
对国内新药的注册检验，也应请企业提供方法验 证资料，如果企业提供不出方法学验证资料，根 据药品注册管理办法，应在审核意见中明确指出 “方法学未经验证，无法检验”，并建议企业重新 建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。监督 抽验药品，由于2005年版以前历版《中国药典》 未强调进行方法学验证，故各药检所目前在进行 具体品种检验时难度较大，故也应请企业提供方 法验证资料并进行审核，未经过方法学验证的 “微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决不能给 出“符合2005年版《中国药典》的规定”的结论。
加菌量:＜100cfu。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列 要求进行操作。对每—试验菌应逐一进行验证。
验证方法： 直接接种法 薄膜过滤法
薄膜过滤法
将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗， 在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验 菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培 养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤 筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入 等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5 天。各试验菌同法操作。
无菌检查验证用菌株：
金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501]