无菌检查方法验证方案
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证1. 概述将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。
2. 验证前提条件供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。
种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。
照此原则,多规格制品按下表选择供试品进行验证。
3. 验证方法3.1菌液制备3.1.1细菌菌液制备程序①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。
用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。
②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜面上，于30~ 35°C培养18h~24h。
取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。
③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
无菌检验方法验证
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无菌检验阳性结果调查
实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的
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无菌检验阳性结果调查
若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染 原因和污染源 –人 – 物料 – 环境 – 设备 – 方法和工艺
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个，
如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
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验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品 已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种 的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓 慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进 一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性， 并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低 抑菌活性。
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
无菌检验技术—无菌检查方法验证
• 3.3无菌检查的范围 • 凡进入人体无菌部位(人体的血液循环பைடு நூலகம்统、肌肉、皮下组织)或接触创
伤、溃疡面等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料、无菌器具均应 进行无菌检查。对于规定灭菌的药物，包括注射剂及用于体腔、严重烧 伤、溃疡及眼科用药等，必须严格无菌，即在规定检验量的供检品中不 得检出活微生物。
任务3 无菌检验方法验证 知识点3 无菌检查方法
• 3 无菌检查方法 • 3.1无菌检查法概念 • 无菌检查法是指检查《中国药典》要求应无菌的药品、医疗器具、原料、 辅料及其他要求无菌的品种是否染有活菌的一种方法（供试品符合无菌检查 法的规定，仅进表明了供试品在该检查条件下未发现被微生物污染）。 • 为了保证药品的卫生质量，保证药品在临床上的安全使用和保障人民的健 康，《中国药典》规定：注射用药、灭菌的外用制剂等均需做无菌检查。
• 的制剂。心脏瓣膜以及固定金属板和有机器材等。
• (3)冲洗剂，即用于冲洗开放性伤口或腔体的冲洗剂。
• (4)眼用制剂。
• (5)用于烧伤、创伤或溃疡的制剂。包括：用于烧伤或严重创伤的局部用 散剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂；用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂和喷 雾剂等。
• (6)用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂或洗耳剂。 • (7)用于手术或创伤的鼻用制剂。 • (8)用于止血并可被组织吸收的制剂。如明胶发泡剂、凝血酶等，用于止
• 3.2验证目的 • 确认所用的无菌检查方法适用于“所有无菌产品”的无菌检查。 • 确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重现性以及检查方法的完整 性。 • 通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即无菌产品的生产全过程 进行质量监控。 • 3.3验证范围 • “所有无菌产品”的无菌检查。
• 3.4验证条件 • 3.4.1验证用菌株 • 金黄色葡萄球菌 • 菌种传代次数铜绿假单胞菌 • 枯草芽孢杆菌 • 生孢梭菌 • 白色念珠菌
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
注射液无菌检查的方法学验证方案
注射液无菌检查的方法学验证方案注射液的无菌性是医疗领域中最为重要的质量指标之一。
为了确保注射液的无菌性，需要进行方法学验证方案。
本文将介绍一种常见的注射液无菌检查方法学验证方案，确保验证结果准确可靠。
一、验证目的本验证方案旨在验证注射液无菌性检查的方法学准确性和可靠性。
通过验证，可以确保注射液无菌性检查的结果符合预期，并为其他类似检查提供参考。
二、验证对象本验证方案适用于各类注射液无菌性检查方法，包括但不限于常规培养法、膜过滤法、试管法等。
三、验证步骤1. 制定验证计划：明确验证的目标、方法和时间安排等。
2. 准备样品和试剂：收集需要验证的样品和所需试剂，并确认其质量符合要求。
3. 合理布局实验室：确保实验室环境符合无菌实验要求，避免干扰因素的存在。
4. 实验操作：a) 样品准备：按照标准操作程序，制备样品，确保操作无菌。
b) 检测方法操作：按照所选的检测方法，依次进行实验，确保操作无误。
c) 平行实验：为了验证结果的可重复性，进行平行实验，确保结果一致。
5. 结果分析：根据实验结果进行数据统计和分析，得出结论。
6. 结果确认：将验证结果与预期目标进行比较，确认验证是否合格。
7. 编写验证报告：将整个验证过程、操作方法和结果总结编写成验证报告。
四、验证要求1. 严格遵守无菌技术操作规范。
2. 注射液样品的选择应具有代表性和典型性。
3. 实验室环境应符合无菌要求，避免外界干扰。
4. 检测方法的选择应根据实际情况和需求进行。
5. 实验操作过程要规范、准确，确保每个步骤符合方法要求。
6. 结果分析要科学、客观，数据统计要准确无误。
7. 结果确认应根据验证目标和标准进行判断。
8. 验证报告要详细、完整，包括验证目的、方法、结果和结论等。
五、验证结果分析根据实验结果的分析，可以判断注射液无菌性检查方法是否准确可靠。
如果验证结果符合要求并且与预期目标一致，则说明所选的检查方法具有可靠性和精准性。
如果验证结果与预期目标不一致，则需要进一步分析原因，寻找解决方案。
无菌试验方法验证方案
一次性使用无菌医疗器械无菌试验方法验证方案编制：日期：审核：日期：批准：日期：1.验证目的通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。
2.样品信息3.实验设备及器材3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。
3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。
4.验证组成员及职责姓名部门职责品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作5.验证依据《中国药典》2015版和GB/14233.2-20056.验证步骤6.1检测设备计量有效性验证确认以下设备经过校量并在有效期内设备名称是否校验是否在有效期内备注灭菌锅洁净工作台生物安全柜电子天平电热恒温箱霉菌培养箱确认人/日期：审核/日期：6.2培养基适用性检查6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
检查结果见表1。
表16.2.2灵敏度检查6.2.2.1菌液制备方法描述接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。
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安徽捷众生物化学有限公司
无菌检查方法（薄膜过滤法）
验证方案
文件编号：QY·TS·05·007-00
批准日期：年月日实施日期年月日
安徽捷众生物化学有限公司
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案
目录
1．验证目的
2. 验证频次
3. 验证操作内容与要求
3.1. 验证操作试验
3.2 试验菌要求
3.3.验证方法步骤
3.4. 验证准备
3.5验证试验操作
4．验证结果评价分析
5．附件
1．验证目的
确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。
即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2. 验证频次
2.1. 建立药品的无菌检查法时
2.2. 修订检验方法时
2.3. 供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时
3. 验证操作内容与要求：
3.1. 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证操作试验：
3.1.1. 对每一试验菌应逐一进行验证。
3.1.2. 硫乙醇酸盐流体培养基—金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生
孢梭菌。
3.1.3. 改良马丁琼脂培养基—白色念珠菌、黑曲霉。
3.2 试验菌要求：
3.2.1验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保
证试验菌株的生物学特性。
3.2.2验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。
当同时进
行时，若验证试验失败，则供试品的无菌检查结果是不成立的
3.3.验证方法步骤：
3.3.1验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照无菌检查方法（薄膜过滤法）进行平行试验，通过计算回收率来判断无菌检查方法（薄膜过滤法）是否对产品有影响。
3.3.2试验结果可接受标准用无菌标准评价方法“0.9％氯化钠注射液(三层共挤膜袋)的无菌检查”对检品中无菌检查试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。
3.4. 验证准备：准备验证所需的供试品、培养基、试药试剂、仪器设备和菌种。
3.4.1. 培养基
硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁琼脂培养基；营养琼脂培养基；血琼脂培养基备注：
3.4.1.1 培养基应注明来源；如采用市售干粉培养基，应按说明配制。
3.4.1.2 配制后的培养基应按照中国药典附录“无菌检查法”中“培养基的适用性检查”
项下检验无菌性和灵敏度。
3.4.2 仪器设备
3.4.2.1. 净化工作台
3.4.2.2. 生物洁净安全柜
3.4.2.3. 集菌仪
3.4.2.4. 生化培养箱
3.4.2.5. 霉菌培养箱
3.4.2.6. 高温试验箱
3.4.2.7. 台式灭菌器
3.4.2.8. 医药品冷藏柜
3.4.2.9. 微波炉
3.4.2.10. 器具无菌培养皿：（直径90mm）无菌移液管（5ml）等
备注：以上仪器设备需要确认与验证的均应已按要求验证。
3.4.3. 菌种
3.4.3.1. 金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕
3.4.3.2. 枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕
3.4.3.3. 白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕
3.4.3.4. 黑曲霉〔CMCC（F）98003〕
3.4.3.5. 铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕
3.4.3.6. 生孢梭菌〔CMCC（B）64941〕
3.4.4操作环境：
3.4.4.1操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。
3.4.4.2环境洁净度不应低于C级，净化工作台洁净度为A级。
3.4.4.3操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于10pa。
3.4.5试验样品：0.9％氯化钠注射液(三层共挤膜袋) 规格：250ml
①批号：生产日期：
②批号：生产日期：
③批号：生产日期：
3.4.6稀释液和试剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌十四烷酸异丙酯3.4.7验证用微生物名称及其编号
3.4.7.1实验菌株的来源：
3.4.7.2编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成
3.4.8培养基
3.5验证试验操作：
3.5.1试验菌的制备和稀释：
3.5.1.1将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃
下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，23～28℃下培养24～48小时。
3.5.1.2将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在23～28℃下培养5～7天小时。
3.5.1.3将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50～100cfu的
菌悬液。
3.5.2用不同类别的微生物考察供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组
3.5.2.1样品试验组：
A准确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。
B然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。
C 用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50～100cfu试
验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照平皿法测定其菌数。
3.5.2.2菌液组：按中国药典附录“无菌检查法”中“灵敏度检查”项下的菌液制备
A 在平皿中注入1ml的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。
B供试品对照组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。
C稀释剂对照组取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含50～100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。
D 对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的试验人员的测定结果可能有很大
的误差。
所以在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。
E 当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体分散于稀释
液中。
F为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。
G液体培养物直接稀释法较比浊法造成误差小，基本保证每次菌数能控制在要求的范
围内。
I 最终制得的菌悬液应为小于100CFU/ml。
J金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌采用营养琼脂培养基；生孢梭菌采用血琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉采用改良马丁琼脂培养基。
3.5.3培养将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在30～50℃下培养48小时将白色念珠菌、
黑曲霉在23～28℃下培养72小时，点计菌落数。
并将结果记录于附件1。
3.5.4试验结果
3.5.
4.1稀释剂对照组菌的回收率
表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%。
3.5.
4.2试验组的菌的回收率
表中：回收率=（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数的值）÷菌液组的平均菌落数×100%。
4．验证结果评价分析
4.1对验证结果的评审应包括：
（1）验证试验是否有遗漏？
（2）验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？
（3）验证记录是否完整？
（4）验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明合理？是否需进一步补充试验？
4.5. 结果判断：?
4.5.1..供试品按无菌检查法进行检查，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，结果
判断验证无效，并重新进行方法验证。
4.5.2如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量，
增加培养基用量，使用中和剂或灭菌剂；更换滤膜品种等方法，并重新进行方法验证。
5．附件
附件1
产品试验组的微生物生长检查记录：
供试品对照组的微生物生长检查记录
稀释剂照组的微生物生长检查记录
菌液组
测试人/测试日期：复核人/复核日期：附件2
附件3
附件4。