无菌检查方法学验证
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
无菌检验方法验证
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无菌检验阳性结果调查
实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的
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无菌检验阳性结果调查
若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染 原因和污染源 –人 – 物料 – 环境 – 设备 – 方法和工艺
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个，
如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
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验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品 已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种 的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓 慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进 一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性， 并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低 抑菌活性。
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
美罗培南无菌检查的方法学验证
美罗培南化学名称为： （ ４ Ｒ， ５ Ｓ ， ６ Ｓ ） 一 ３ － ［ ［ （ ３ Ｓ ， ５ Ｓ ） 一 ５ 一 （ 二 ＝ ： 甲基氨 甲酰基） 一 ３ 一 吡咯烷】 硫】 － ６ 一 【 （ １ Ｒ ） 一 １ － 羟 乙基卜４ 一 甲基一 ７ 一 氧一 １ 一 氮双环【 ３ ． ２ ． Ｏ ］ 庚一 ２ 一 烯一 ２ 一 羧酸三水合物。美罗培南为人工合成 的广谱碳青霉烯类抗生素 ， 容易穿透 大 多数革兰 阳性和阴性细 菌的细胞壁 ，而达到其作用靶点青霉素结合蛋 白 美罗培南与氨基糖苷类抗生素合用可产生协同作用ｌ １ 。 美罗培南适用于成人 和儿童由单一或多种对美罗培南敏感 的细菌引起的肺炎、 子宫 内膜炎、 皮肤 软组织感染、 败血症等。无菌检查法系用于检查药 典要求无菌 的药 品、 医疗 器具、 原料、 辅料及其他 品种是否无菌的一种方法［ ６ － １ ３ ］ 。本实验对美 罗培南无 菌检硷方法进行验证。 １ 试 验环 境 与 材料 １ ． １试验环境： 在环境洁净度为 Ｂ ＋ Ａ的无菌室中进行 。 ｌ ＿ ２仪器： Ｎ Ｋ Ｆ ３ ３ ０一次性全封 闭集菌培养器 （ 温州图旺生物技 术设备有 限公司） 、 ＨＴ Ｙ一 ６ ０ １智能集菌仪 （ 温州 图旺生物技术设备有限公司） 、 Ｈ Ｙ 一 ２ （ Ａ ） 调速 多用 振 荡 器 （ 东莞 康 润 仪器 设 备 有 限 公司 ） 、 Ｓ Ｐ Ｘ 一 ２ ５ ０智 能 生化 培 养 箱（ 北京北瑞达医药科技有限公司） 、 ＭＪ Ｘ一 １ ５ ０ Ｂ智能霉菌培养箱 （ 北京北瑞 达 医 药 科技 有 限 公 司） 、 Ｙ Ｘ Ｑ － Ｌ Ｓ 一 ３ ０ Ｓ Ｉ Ｉ 高 压 灭 菌锅 （ 西 安 常仪 仪 器 设 备 有 限
Ｉ ３试验用菌株 ： 生孢梭 菌［ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ６ ４ ９ ４ １ １ （ 第 ４代 （ 上海北诺生物科 技有限公司） 、 白色念珠菌ｌ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ９ ８ ０ ０ １ 】 （ 第 ４代） （ 上海北诺生物科技有 限公司） 、 金黄色葡萄球菌［ Ｃ ＭＣ Ｃ （ Ｂ ） ２ ６ ０ ０ ３ １ （ 第 ４代） （ 上海北诺生物科技有 限公司） 、 枯草芽孢杆菌［ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ６ ３ ５ ０ １ １ （ 第 ４代） （ 上海北诺生物科技有限 公司） 、 大肠埃希菌 Ｅ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ４ ４ １ ０ ２ ３ （ 第 ３代） （ 七 海 北诺生物科技有限公 司） 、 黑 曲霉［ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ９ ８ Ｏ Ｏ ３ ］ （ 第 ３代） （ 上海北诺生物科技有限公 司） 。 ｌ － ４培 养基 、 稀释 液 及缓 冲 液 １ ． ４ ． １干粉培养基： 硫 乙醇酸盐培养基 （ 』 东环凯微生物科技有 限公司） 、
无菌检验方法验证
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌检查方法验证报告
无菌检查方法验证报告目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 接受标准 (3)4. 抽样计划 (3)5. 设备、试剂和菌种信息 (3)6. 试验步骤 (4)7. 供试品检查 (6)8. 结论 (6)9. 再验证周期 (6)10. 附件清单 (6)1.目的支据中国药典2020版无菌检查法的要求，对产品的无菌检查法进行验证，以确定一种无菌检查的方法能有效的消除该产品对微生物的抑制作用，从而证实该方法的有效性和实用性。
2.适用范围适用于本司产品的无菌检查。
3.接受标准与阳性对照比较，含供试液各容器中的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉）均生长良好，则可照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器内的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需进一步改进检验条件再进行方法验证试验。
4.抽样计划随机抽取灭菌后的样品24份。
具体信息见表一：表一样品信息确认人/日期：复核人/日期：5.设备、试剂和菌种信息5.1设备信息详见表二表二设备信息确认人/日期：复核人/日期：5.2试剂信息详见表三：表三试剂信息确认人/日期：复核人/日期：5.3菌种信息详见表四：表四菌种信息确认人/日期：复核人/日期：5.3.1菌液的制备用接种环取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取生孢梭菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的第四代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的第三代培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
以上操作均在微生物检验室阳性菌室的生物安全柜中进行。
注射用万古霉素无菌检查方法学验证
试验样品处理
试验步骤
按照无菌检查方法学的要求，对试验样品进行处理，包括稀释、加 药、培养等步骤。
操作规范
在处理试验样品的过程中，需要严格遵守无菌操作规范，避免样品 中的微生物污染实验环境。
数据记录
记录每个试验样品的无菌检查结果，包括微生物种类、数量等。
03
方法学验证实验
样品准备
取注射用பைடு நூலகம்古霉素样品，用无菌方法将样品分别装入无菌容器中。
注射用万古霉素无菌检查方 法学验证
汇报人：
日期:
• 引言 • 方法学验证方案 • 方法学验证实验 • 方法学验证结果分析 • 注射用万古霉素无菌检查方法学验
证总结
01
引言
目的和背景
目的
确保注射用万古霉素的无菌检查方法具有可靠性、准确性和可重复性，为产品质量控制提供有力支持 。
背景
注射用万古霉素是一种广泛应用于临床治疗的抗生素药物，其无菌质量对于保障患者安全具有重要意 义。因此，对无菌检查方法进行验证是保证药物安全性的关键环节。
参考标准
《中国药典》2020年版
规定了注射用万古霉素的无菌检查方法和要 求。
《无菌检查法》国家药品标 准
提供了无菌检查方法学的通用指导原则。
《微生物限度检查法》国 家药品标准
提供了微生物限度检查的方法学指导原则。
定义与术语
无菌检查
01
指对药物中是否含有微生物的检查方法，是确保药物
无菌的重要手段。
实验设计
根据无菌检查方法学验证指导原则，设计实验方案，包括实验组和对照组。
实验操作
按照实验设计方案，分别对实验组和对照组进行无菌检查实验。
培养与观察
将实验组和对照组的培养皿放入无菌培养箱中培养 ，每天观察并记录培养结果。
无菌检查法及其验证
无菌检查法及其验证
第8页
培养基储存
• 制备好培养基应该保留在2-25℃、避光环 境，若保留于非密闭容器中，普通在3周内 使用；若保留于密闭容器中，普通可在1年 内使用。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 使用期。
无菌检查法及其验证
第9页
培养基适用性检验
本检验可在供试品无菌检验前或与供试品 无菌检验同时进行。 • 无菌性检验
无菌检查法及其验证
第24页
阳性对照试验
• 目标：①验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌作用， 确保检验条件符合要求，预防出现假阴性。②培 养条件是否符合要求。
• 应依据供试品特征选择阳性对照菌。 ①无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 ②抗革兰阴性-大肠埃希菌
③抗厌氧菌-生孢梭菌 ④抗真菌-白色念珠菌
无菌检查法及其验证
第28页
• 对无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不 符合无菌检验法要求；
• 回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原 因；
• 供试品管中生长微生物经判定后，确证有微生物生 长是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技 术不妥引发。
无菌检查法及其验证
第29页
试验若经确认无效，应重试。重试时，重 新取同量供试品，依法重试，若无菌生长， 判供试品符合要求，若有菌生长判供试品 不符合要求。
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基都有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
第14页
培养基适用性检验
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌培养 基管均生长良好，判该培养基灵敏 度检验符合要求。
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无菌检查方法学验证
1. 概述
将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。
2. 验证前提条件
供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。
种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。
照此原则,多规格制
品按下表选择供试品进行验证。
3. 验证方法
3.1菌液制备
3.1.1细菌菌液制备程序
①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。
用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。
②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养
肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。
取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流
体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。
③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。
④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。
3.1.2抱子悬液制备程序
①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细
吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。
用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。
取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。
②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜
面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。
3.2 薄膜过滤
3.2.1 供试品试验组
取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml,在最后一次冲洗液中，加入1ml 验证菌液。
每种制品抽取三批按上法操作。
3.2.2阳性对照组
取一套与供试品试验组相同的集菌培养器,不过滤供试品,直接向与供试品试验组相等量的培养基内接入1ml 的验证菌液。
3.2.3阴性对照
取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，另一只滤筒内接入100ml硫乙醇酸盐流体培养基。
7.3.3.4培养
将硫乙醇酸盐流体培养基置于30~35C培养,改良马丁培养基置于20~25C ,分别在培养的第1、2、3、4、5天观察并记录结果。
7.3.3.5可接受标准
所有验证用试验菌种均能在供试品组和阳性对照组中生长良好,并且同一试验菌在供试品组和阳性对照组中生长的时间及强弱应没有明显差异。
阴性对照应无菌生长。
各品种三批验证结果均应符合上述要求。