分子细胞遗传学技术(精)

分子细胞遗传学技术 与产前诊断
南京大学医学院 王亚平
2006年11月
基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系
一、分子细胞遗传学技术
荧光原位杂交技术（fluorescence
in site
hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针， 与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺 陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500 kb.
染色体技术的
应用－2
inv(9)(p12q13)
分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失
细胞遗传学研究中染色体技术的应用
21号染色体涂染探针FISH杂交， 显示21三体
9号染色体涂染探针杂交。 箭头示易位到10号染色体上 的来自9号染色体的片段
比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）
变中最多见的形式。
•。
动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重
复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生
明显变化。
点突变的结果：
（1 ）同义突变（ samesense mutation ）：碱基替换后，虽 然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码 的兼并性），亦称静止突变。 （ 2 ）错义突变（ missense mutation ）：碱基替换，密码 子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨 基酸。 （3）无义突变（nonsense mutation）：碱基替换后，使 编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 （4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变 蛋白质功能的“错义突变”
1. 无义突变和移码突变： 2. 稀有的错义突变： 60％
微小突变
20％
3. DNA大片段缺失或重复: 20％
另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点
（二）目前常用的对已知点突变的分析技术
• 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）
• 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）
基因突变形式—碱基的插入和缺失
• 碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或
几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编
码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（ frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。
碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变
（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现 终止密码产生截短型蛋白
CGH的优点：
• 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体 区带水平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和 定位。 • 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体 瘤尤为适用。 • 所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马 林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检 测，利于做回顾性研究。
• DNA芯片
1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析
• 当突变影响到某一限制性内切酶位点时，
可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制性片 段长度多态性（RFLP）
2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）
• 通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补， 一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物及3’ 端引物进行两个平行的PCR，分析结果。
CGH的局限性：
• 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基
因重排，倍体水平改变。 • 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在， 肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。 • 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 — 30MB）
二、突变分析与分子诊断
（一）基因突变类型
• 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突
缺失突变
基因突变形式
• 框内突变（ inframe mutation ）： 3 个或是的 倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢 失或增加1个或几个氨基酸。
• DNA 大片段缺失或复制（ large deletion or
duplication) ：几百个bp至几十个kb的碱基缺
失或复制。
各种类型病理性突变的比例
应用15号染色体一基因特异性 探针（红色）杂交确定其是否 缺失；绿色探针鉴定15号染色 体着丝粒。
24种不同染色体涂染探针杂 交得到的彩色染色体
染色体技术的
应用－1
inv(14)(p12q24)
t(2; 11)(2q34; 11q13)
细胞遗传学研究中染色体技
术的应用—FISH技术检出
t(2; 14)
• 近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗 传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不 同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA，然 后与正常人中期细胞染色体杂交。
• 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤 细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。 • 这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。
3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）
• 设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的 位点，一段与野生型链互补，一段与突变型链 互补。 • 杂交分析是否存在突变
荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针
• 基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努 力，越来越多的这方面探针可以使用 • 着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体 和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。 • 全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅 含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA 序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中 期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素， 在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。
比较基因组杂交的原理
• 待测DNA（肿瘤 细胞DNA，test DNA)为绿色
• 参照DNA(正常 细胞DNA， reference DNA） 为红色
• 复染为蓝色
人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交
A. 中期染色体的DAPI的 复染图
B. 中期染色体比较基因组杂 交（CGH）：红色区域表示
丢失，绿色区域表示扩增。