双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件
测序原理及流程图
测序原理及流程图
测序原理
目前关于测序方法主要采用双脱氧链终止法，双脱氧链终止法又称为Sanger法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。
如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。
经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可获得合成片段的碱基排列顺序。
我们使用的是ABI3730测序仪以及配套的BigDye Terminator Kit，original v3.1我公司目前采用Applied Biosystems 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛。
3730XL可同时分析96个样品，该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。
测序流程图。
掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。
由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。
本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。
实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。
每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。
但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。
例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。
将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。
其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。
由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。
故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。
[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。
(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。
2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。
DNA及测序ppt课件
如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核 苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4组 独 立 的 DNA合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4种 不 同 的 ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
5´
G A C T G A A G C T G T T
5´
C
T
G
A
C
T
T
C 读出待测 G
序列
A C
A
A
3´
（二）化学裂解法测序原理
用化学试剂处理末端放射性标记的 DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此 产生的一组具有不同长度的DNA链的反应 混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自 显影之后，便可根据x光底片上所显示的 相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷 酸序列。
一、传统测序方法
（一）双脱氧链终止法(Sanger法) （二）化学裂解法（Maxam-Gilbert）
（一）双脱氧链终止法测序原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 （2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖 的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷 酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷 酸链的延伸终止。
如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP， 则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列 长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中， 分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将 分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸 链进行高分辨变性聚CGGTAGCAACT 5´ 引物 5´ GG 3´
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因序列拼接和分析PPT课件
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合 物全部平行地点加在 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳， 每组制品中的各个组 分将按其链长的不同 得到分离，从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 基序列。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
1
实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质技术主要有两种方法，都是 在20世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸 链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产 生切口，用同位素标记进行测序。
5
6
2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上
述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷 三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然 后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机 地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继 续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A 就终止了。
13
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析共48页文档
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列
拼接和分析
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
双脱氧终止法的原理(一)
双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。
它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。
•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。
2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。
这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。
dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。
•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。
反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。
•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。
DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。
•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。
•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。
碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。
电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。
•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。
•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。
3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。
•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。
DNA的测序方法、原理
3） DNA自动化测序
特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h
三种测序的比较
1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化 类似末端终止法，所 不同的是用荧光染料 标记，计算机自动读 出。
使用特异性引物与 用化学试剂在A、G、 单链模板DNA退火， C、T处特定的裂解 在DNA聚合酶作用 DNA片段，产生一簇 下进行延伸反应， 各种长度的短链，经 用ddNTP终止，用 过PAGE放射自显影 PAGE区分长度仅 可直读DNA顺序。 相差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成 测序的方法。 优点 简便、迅速、应用 广泛。
DNA的测序方法、原理
一、DNA序列测定
其基本原理是DNA 的复制反应体系中需要存在DNA 聚合 酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成 双链后，DNA 聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’ 的方向移动，dNTP 按照碱基配对原则，逐个连接在引物的 3’-OH 末端。
1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止 反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子， 从而来读取待测DNA分子的顺序。
不需酶促反应，可以 1、高负荷，1块胶可 对寡核苷酸测序。 测16个样品；2、机读 不需放射自显影；3、 安全不用同位素；4、 简单迅速8-10h。
用于终止反应的双脱氧核苷酸：
将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参 入到新合成的DNA链中，由于参入的 ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与下一位 核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反 应将中止。
双脱氧终止法测序的原理
双脱氧终止法测序的原理双脱氧终止法测序，听起来是不是有点复杂？其实它就像一场科学界的精彩戏剧，让我们一起看看这个有趣的过程吧！这种测序方法的名字就有点意思，“双脱氧”听上去像是什么魔法药水，其实它是DNA的基本构件之一。
想象一下，DNA就像一条长长的双螺旋楼梯，而我们要做的，就是找出这条楼梯上每一步的秘密。
说白了，就是要弄清楚DNA里面的“字母”是什么。
好了，首先要准备一些小助手，叫做“脱氧核苷酸”，这些小家伙是DNA的拼图块，它们有四种，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
这个时候，我们的主角“DNA模板”登场了，科学家们会把要测序的DNA分子放进去，然后加上这些脱氧核苷酸。
听到这，你是不是有点兴奋？就是关键时刻，加入了特殊的“终止剂”，就像在比赛中设立了终点线。
这时候有趣的事情发生了！终止剂会和脱氧核苷酸结合，导致DNA合成在某个特定位置停止。
就像我们在聚会上跳舞，忽然DJ放了一首慢歌，大家都停下来了。
这个停下来的点，正好就是我们需要记录的“字母”。
科学家们用各种方法把这些终止的DNA 片段分开，然后再进行分析，最终把每一个“字母”都一一拼凑起来。
可能有些朋友会问了，这种方法有什么特别之处呢？双脱氧终止法是非常准确的，就像精致的钟表，能精确到每一秒。
这种方法的发明者还因此获得了诺贝尔奖，真是值得点赞！这种测序方式的应用可广泛了，比如在医学上帮助我们了解基因病，或者在考古学上让我们找到古老DNA的秘密。
多么令人兴奋的科学探索啊！这一切的背后，都离不开科学家们的努力。
想象一下，他们在实验室里穿着白大褂，手里拿着各种设备，脸上挂着认真又兴奋的神情。
为了一个个数据，他们可谓是绞尽脑汁，有时候甚至会遇到意想不到的挑战。
比如，可能会出现一些干扰因素，影响测序的准确性，这时候就得重新审视整个过程，确保每一步都走得稳稳当当。
双脱氧终止法测序就像是科学界的一场大冒险，既有挑战又有惊喜。
每一个字母的拼凑，都像是解开了一道道谜题，让我们更加了解生命的奥秘。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
底物：dNTP 模板：单链DNA
引物：需要
引物的作用：提供3’羟基 末端
.
ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。度相当高！能 分离长度达300500个碱基，而 差别仅一个碱基 的同系单链核苷 酸序列。
.
.
Thank you!
.