PCR引物设计及测序结果分析
定量PCR 引物、探针设计原则
定量PCR 引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→目的DNA第二步：保持GC）?典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
?探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
PCR引物设计详细步骤
PCR引物设计详细步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于放大DNA片段。
在PCR过程中，引物的选择非常重要，因为引物的设计质量直接影响到PCR反应的效率和准确性。
本文将详细介绍PCR引物设计的步骤。
步骤1. 确定目标序列首先，需要确定所要放大的目标序列。
这可以是任何你感兴趣的DNA片段，如某个基因的编码区域，特定的DNA序列等。
2. 提取目标序列从已有的DNA样本中提取目标序列。
可以通过DNA提取试剂盒等方法进行提取，确保获得纯净的DNA。
3. 序列比对使用BLAST等工具将目标序列与已知的序列数据库进行比对，以确认目标序列的唯一性和可能存在的变异。
4. 引物设计原则根据目标序列，设计符合以下原则的引物：•引物长度通常在18-25个碱基对之间。
•碱基组成均匀，避免引物中存在大量的G或C碱基，以及连续多个重复的碱基。
•引物之间的互补性尽量避免，以防止二聚体的形成。
•避免引物末端存在碱基的互补序列，以防止非特异性扩增。
5. 引物设计工具使用引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等，在目标序列中选择合适的引物。
这些工具可以根据给定的参数，自动设计合适的引物。
6. 引物评估对设计的引物进行评估，包括检查引物的反向互补性、引物的Tm值（熔解温度）、引物的二聚体和自身结构等。
确保引物的质量达到实验要求。
7. 引物合成将设计好的引物发送给合成公司进行合成。
确保引物的纯度和浓度符合要求。
8. PCR反应使用合成的引物进行PCR反应，按照标准的PCR反应体系和条件进行。
根据实验需求调整PCR反应的温度、时间等参数。
9. PCR产物验证通过凝胶电泳等方法验证PCR反应产物的大小和纯度。
确保PCR反应成功，并且没有非特异扩增的产物。
结论PCR引物设计是PCR反应成功的关键。
通过遵循引物设计的原则，结合引物设计工具的辅助，可以设计出合适的引物，弥补PCR技术在DNA放大中的巨大优势，为实验研究提供有效的工具。
实验五 PCR引物设计及评价
实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。
这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。
常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。
过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。
引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
分子生物学中的PCR技术及其应用实例
分子生物学中的PCR技术及其应用实例PCR（聚合酶链反应）技术是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、DNA测序、病因检测等领域。
本文将就PCR技术原理、扩增机制、优化技巧及其应用实例进行探讨。
一、PCR技术原理PCR技术是一种体外的DNA扩增技术，通过特定的引物和聚合酶的作用，在体外模拟DNA自然复制的过程，从而在短时间内扩增目标DNA片段。
该技术根据DNA双链分子在高温下变性再回复到原状态的特点，将DNA的变性、退火、延伸等过程结合在一起，实现DNA序列的指数级扩增。
二、PCR技术扩增机制PCR技术的扩增过程包括三个阶段：变性、退火与延伸。
1.变性阶段：将反应体系中DNA分子加热至90~95℃，使其双链分子变性为单链。
2.退火阶段：将反应体系中的温度降至50~65℃，使引物结合至目标DNA上，并通过引物特异性与目标DNA碱基互补，形成DNA单链结构。
3.延伸阶段：将反应体系中温度升至72℃，聚合酶结合引物上，开始向目标DNA上的方向进行DNA链延伸。
延伸的长度取决于引物长度和反应时间，延伸后生成新的DNA双链复合物，反复进行三个阶段的循环操作，最终可扩增数百万份目标DNA的分子。
三、PCR技术的优化技巧PCR技术使用方便，特异性好，扩增速度快，但仍然有一些问题需要注意：1.引物的设计：引物的设计是PCR技术的一个重要环节。
应选择特异性好、长度适当、与目标DNA序列互补性强的引物。
2.缩短扩增时间：PCR反应时间一般需要数小时，较大地限制了其应用范围。
在加大酶的浓度、优化反应体系中缩短PCR反应时间，可提高反应效率。
3.增加扩增产物数量：一般来说，反应体系中DNA数量的下限约为0.1ng。
可以通过调整引物浓度、酶浓度、反应体系条件，提高扩增产物数量。
四、PCR技术应用实例PCR技术在基因分析、DNA测序、病因检测等领域中被广泛应用。
以下分别介绍其应用实例：1.基因分析：PCR技术可用于DNA聚集的检测、DNA变异检测等基因分析中。
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
特异引物设计实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习并掌握特异引物设计的方法，通过实验验证设计引物的正确性，为后续的PCR实验提供高质量的引物。
二、实验原理特异引物设计是分子生物学实验中的一项重要技术，主要用于PCR、实时定量PCR等实验中，通过设计特定的DNA序列作为引物，在模板DNA上扩增出目的基因片段。
特异引物设计的关键在于确保引物与目标DNA序列的高度特异性，避免非特异性扩增。
三、实验材料1. 质粒DNA模板；2. 引物合成试剂盒；3. PCR仪；4. 电泳仪；5. DNA电泳凝胶；6. 紫外线灯；7. 引物设计软件（如Primer Premier）；8. 其他试剂（如PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq酶等）。
四、实验方法1. 引物设计使用引物设计软件（如Primer Premier）设计特异引物。
根据目标DNA序列，选择合适的引物长度（通常为20-30 bp），确保引物与目标DNA序列具有高度特异性。
同时，考虑引物的Tm值、GC含量、引物之间的退火温度等参数。
2. 引物合成按照引物合成试剂盒说明书进行引物合成，得到特异引物。
3. PCR反应将质粒DNA模板、特异引物、PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中，进行PCR反应。
反应程序如下：- 预变性：95℃，5 min；- 循环扩增：95℃，30 s；55℃（根据引物Tm值调整），30 s；72℃，1 min；- 最后延伸：72℃，10 min。
4. PCR产物分析将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
如果出现与预期片段大小一致的条带，说明引物设计正确。
5. 引物验证将PCR产物进行纯化，并进行测序，验证引物特异性。
五、实验结果与分析1. 引物设计结果通过引物设计软件，成功设计出符合要求的特异引物，引物长度为25 bp，Tm值为59.5℃，GC含量为45%。
2. PCR反应结果PCR反应后，在琼脂糖凝胶电泳上观察到与预期片段大小一致的条带，说明引物设计正确。
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
实验四外源基因的多重PCR检测
产物鉴定
通过测序或限制性酶切的 方法对PCR产物进行鉴定， 验证是否为外源基因。
05 实验结果与分析
多重pcr产物的电泳分析
总结词
通过电泳分析，可以观察到清晰的条带，表明多重pcr产物的 大小与预期相符。
详细描述
通过琼脂糖凝胶电泳，我们可以看到在预期的分子量范围内 ，有多条清晰的条带出现。这些条带的亮度较高，说明pcr产 物量较大。此外，条带没有出现弥散，说明pcr产物较为纯净 ，没有出现非特异性扩增。
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对未来研究的建议与展望
01 02 03 04
深入研究多重pcr检测的原理和机制，提高检测的灵敏度和特异性。
开发更多针对不同外源基因的多重pcr检测方法，扩大应用范围。
加强多重pcr检测在实际应用中的验证和评估，提高其在实践中的可 靠性。
加强与其他相关技术的结合，如测序技术、生物信息学等，以实现更 全面、深入的研究和应用。
实验四外源基因的多重pcr检测
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01 实验目的
理解多重pcr检测的原理
总结词：深入理解
详细描述：多重pcr检测基于聚合酶链式反应（pcr）技术，通过一对或多对引物， 在体外快速扩增特定的DNA片段。在反应过程中，引物与模板DNA结合，经过一系 列的变性、退火和延伸步骤，实现DNA的扩增。
02 实验原理
多重pcr检测的概述
定义
多重PCR是一种在单个反应中同时扩增多个DNA片段的聚合酶链 式反应。
优点
提高实验效率，减少实验成本和时间，同时检测多个基因或DNA 片段。
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Content
聚合酶链式反应（PCR） 的技术 原理及结果分析
PCR引物设计原理及相关软件的使 用（ Primer Premier 5.0 ）
测序结果分析
一 . PCR的技术原理及结果分析
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) ，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 ，故又称为基因的体外扩增法。
引物二聚体
发夹结构
7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基 ，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位
点5’端加上适当数量的保护碱基）。
5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物
中引入该位点的点突变以作研究。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突 变检测的敏感性。
二. PCR引物设计原理及相关软件的使用 （ Primer Premier 5.0 ）
引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物同源性分析 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 酶切位点及保护碱基的添加
94˚C
Tm
从结合在特定 DNA模板上的 引物为出发点 ，按5’→3’的 方向沿着模板 顺序合成新的 DNA链
72˚C
PCR出现的问题：
引物是否合 适?
PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性 ）？ 扩增的目的条带很弱？
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环
PCR结果分析
引物（primers)
引物是人工合成的两段寡
核苷酸序列，一个引物与
感兴趣区域一端的一条 DNA模板链互补，另一个 引物与感兴趣区域另一端 的另一条DNA模板链互补
5’ 3’
Sense primer
5’
→
Antisense primer
←
3’
。(上游引物与DNA序列一
致,下游引物要反相互补.)
引物的重要性
正义链
反义链
Hale Waihona Puke 基本分子生物学研究手段PCR PCR反应液体的成分: PCR循环的程序:
PCR原理：
基本分子生物学研究手段
RT-PCR
反转录PCR
mRNA---cDNA-----PCR
基本分子生物学研究手段
Cutting by enzymes
基本分子生物学研究手段
Southern Blot
基本分子生物学研究手段
PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）
PCR常见问题
1. 无扩增产物
模板:含有抑制物，含量低
Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高
2. 非特异性扩增
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 退火温度偏低 循环次数过多
3. 拖尾
在整个PCR体系中,
引物占有十分重要的
地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA
特异结合，不与其他非目的DNA结合，
PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物
进行有效的延伸，可见引物设计好坏与
PCR结果密切相关。
引物设计原则
引物长度
碱基分布的均衡性
Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上 下游引物的GC含量不能相差太大。
3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位， 且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
6.
引物无回文对称结构，否则会形成发夹 结构；引物自身不能配对，否则易形成约 两个引物长度的引物二聚体；
PCR的应用
1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基
因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变：
可以随意设计引物在体外对目的基因片段
进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低 ，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中， 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检 测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
M
1
2
模板不纯或降解 Buffer不合适
退火温度偏低
酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
产物在凝胶上呈Smear状态
4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。 设置阳性和阴性对照，重复实验
引物的内部稳定性
引物的保守性与特异性
扩增区域的二级结构
基本原则：
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构
引物不能在模板的非目的位点引发DNA
聚合反应(即错配)。
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。
尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机 制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这 一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
Northern Blot
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
模板DNA
预变性
dNTP
引物
94oC
5’
Buffer
循 环 仪
94℃
55 ℃
72 ℃
PCR技术的基本过程
变性
退火
延伸
在加热或碱性 条件下可使DNA 双螺旋的氢键 断裂，形成单 链DNA
模板与引物的 复性,引物是与 模板某区序列 互补的一小段 DNA片段。