第二章层析技术幻灯
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《层析技术》课件
关键突破
20世纪50年代的气相层析和液相层析的发展为该技术的应用奠定了基础。
扩大应用
20世纪60年代起，层析技术逐渐被应用到生物化学、医药学等领域。
层析技术原理
层析柱的构成
层析柱由固定相填充而成，固定相具有不同的选择 性，用以分离目标物质。
分离原理
分离原理包括吸附、离子交换、分配和亲和等不同 机制。
食品科学
食品质量检测和添加 剂分析中，层析技术 广泛应用。
环境检测
层析技术可用于水质 监测、环境污染物分 析等领域。
层析技术的优缺点
1 优点
层析技术操作简单，分离效果好，适用于不同样品类型。
2 缺点
层析技术对分离介质的选择敏感，操作条件需谨慎控制。
层析技术的发展趋势
1
检测方法的提高
2
新的检测方法提高了层析技术的灵敏度
和选择性。
3
制备方法的改进
新的制备方法使层析柱更高效、更可靠。
应用领域的扩展
层析技术在新兴领域如环境保护和药物 控制中得到了更广泛的应用。
结论
层析技术的重要性
层析技术在科研和工业领域中的应用不可替代。
层析技术的未来发展展望
随着技术的进一步发展，层析技术将在更多领 域发挥重要作用。
层析技术的分类
按照分离方式的分类
层析技术可分为液相层析、气相层析、超高效液相 层析等不同类型。
按照分离介质的分类
层析技术可使用不同的分离介质，如硅胶、反相材 料和离子交换树脂等。
层析技术应用
生物化学
层析技术在生物化学 中用于酶分离、蛋白 质纯化等关键步骤。
医药学
层析技术在药物分析 和药物研发中发挥着 重要作用。
《层析技术》PPT课件
20世纪50年代的气相层析和液相层析的发展为该技术的应用奠定了基础。
扩大应用
20世纪60年代起，层析技术逐渐被应用到生物化学、医药学等领域。
层析技术原理
层析柱的构成
层析柱由固定相填充而成，固定相具有不同的选择 性，用以分离目标物质。
分离原理
分离原理包括吸附、离子交换、分配和亲和等不同 机制。
食品科学
食品质量检测和添加 剂分析中，层析技术 广泛应用。
环境检测
层析技术可用于水质 监测、环境污染物分 析等领域。
层析技术的优缺点
1 优点
层析技术操作简单，分离效果好，适用于不同样品类型。
2 缺点
层析技术对分离介质的选择敏感，操作条件需谨慎控制。
层析技术的发展趋势
1
检测方法的提高
2
新的检测方法提高了层析技术的灵敏度
和选择性。
3
制备方法的改进
新的制备方法使层析柱更高效、更可靠。
应用领域的扩展
层析技术在新兴领域如环境保护和药物 控制中得到了更广泛的应用。
结论
层析技术的重要性
层析技术在科研和工业领域中的应用不可替代。
层析技术的未来发展展望
随着技术的进一步发展，层析技术将在更多领 域发挥重要作用。
层析技术的分类
按照分离方式的分类
层析技术可分为液相层析、气相层析、超高效液相 层析等不同类型。
按照分离介质的分类
层析技术可使用不同的分离介质，如硅胶、反相材 料和离子交换树脂等。
层析技术应用
生物化学
层析技术在生物化学 中用于酶分离、蛋白 质纯化等关键步骤。
医药学
层析技术在药物分析 和药物研发中发挥着 重要作用。
《层析技术》PPT课件
蛋白质层析技术PPT课件
2
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
54
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
54
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
最新生物化学技术3吸附层析ppt课件
二、应用实例
1．用DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端
2．用DABTH—氨基酸的薄层法分析蛋白质序列
结束语
谢谢大家聆听！！！
43
化的
10．膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积
（用Vβ表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大
11．分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示
12.迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移
动距离之比值。常用Rf表示
第三节 聚酰胺薄膜层析
一、聚酰胺薄膜层析的概念
聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方 法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨 基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1） 时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优 点，它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄 层层析(茚三酮法)等方法
➢吸附层析 的固定相
极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性：如活性碳等
➢流动相通常为有机溶剂或缓冲液
一、常 用 术 语
1．固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸
附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的 溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶 解和交换作用
加样操作示意图
（五）柱子再生
各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异
六、实例应用
(1)纯化生命物质[72]： 天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HA层析柱 的分离图谱
(2)分离蛋白质的亚基[114] 14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
THANK YOU
感谢聆听
蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
第四节 离子交换层析(第二章)
1、原理
生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不 同的分子大小及电荷排列方式。离子交换剂是通 过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的 化学基团后的产物。可人为选择性地使其带有正 电荷或负电荷。当在一定pH下净电荷为负的蛋白 质分子可通过静电键结合到带正电荷的离子交换 剂(称为阴离子交换剂)上；反之，称为阳离子交 换剂。 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同， 而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变 离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先 后被洗脱下来。
最高分辨率，细 颗粒，小制备量 (g/run, mg/run).
高分辨率，中等颗 粒度(30-40 m)。 可以扩大制备量。 一般分辨率，较大 制备量，较大颗 粒度(60-90 m)。 低分辨率，快速大 容量，大颗粒度 (90-200 m)
最高分辨率，细 颗粒，小制备量 (g/run, mg/run).
脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不 同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自 动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。
3)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不 同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物 大分子的一种重要手段。
由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次 离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离 方法结合使用。 使用离子交换层析分离样品要充分利用其 按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件， 通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。
6）样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐的质量分 数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以 一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处 理。
柱层析装置：
层析柱、部分收集器、磁力搅拌器、恒流泵、检测器
第二章 层析技术1
分配系数K值大,说明物质在层析中被固定相 吸附得比较牢固,随流动相迁移的速度较慢,留在 固定相中的时间较长,在洗脱液中后出峰。若分 配系数K值小，则该物质在洗脱液中较早出峰。 从一个混合物中分离和纯化一种生物物质的纯 度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程 度。 混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易 地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差 较小,不易把混合物中的生物物质分离。
用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树
脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性
的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。
层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸 附型、分配型、离子交换型（离子交换层析）等三种类型。 但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来
力超过了用尼龙粉铺成的薄层。
薄层层析较纸层析优越在于分辨高，展层时间短。例如用纸层析做
氨基酸分析，往往需要两天时间，而且对层析条件要求严格，不易得到
满意的分离效果。如用薄层层析做，一般约需半小时，分离效果更好。 薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。
薄层层析的分析程序
将样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，
样品处理量大，有 浓缩作用，产品回 收率高，应用范围 很广
影响因素较多， 适用于分离大 只适用于水中 分子多价电解 解离的物质 质
分配层析
溶质在两相 溶解度差异
配体专一性 酶与底物抗 原与抗体结 合 分子筛排阻 效应
分辨率高，重复性 好，能分离微量物 质
分辨率很高
影响因子多， 上样量太小
一种配体只能 用于一种生物 大分子，局限 性大 各种凝胶介质 昂贵，处理量 有限制
层 析PPT演示课件
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分配系数K值大,说明物质在层析中被 固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速 度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液 中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在 洗脱液中较早出峰。
18
从一个混合物中分离和纯化一种生物 物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能 较易地把混合物中的生物物质分离。反 之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物 质分离。
42
四.凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖
之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联
OH
聚合而成的三维空间网状结构。
43
特点：
Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交 联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入 交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大, 网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械 强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百 分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号 表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶 吸水量为5ml。
（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水） 通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干 凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g 表示）。
35
Ve - Vo Kd = ————
Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全 不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它 能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的 比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极 端行为之间的分子。
分配系数K值大,说明物质在层析中被 固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速 度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液 中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在 洗脱液中较早出峰。
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从一个混合物中分离和纯化一种生物 物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能 较易地把混合物中的生物物质分离。反 之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物 质分离。
42
四.凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖
之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联
OH
聚合而成的三维空间网状结构。
43
特点：
Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交 联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入 交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大, 网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械 强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百 分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号 表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶 吸水量为5ml。
（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水） 通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干 凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g 表示）。
35
Ve - Vo Kd = ————
Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全 不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它 能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的 比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极 端行为之间的分子。
各类层析色谱分析技术完全讲解 ppt课件
❖ 缺点：刚性差，不耐压，分离时间长
层析介质的性能
❖ 层析介质的形状：球形，不定形 ❖ 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
❖ 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。
❖ 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
三、层析前蛋白质处理
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；
在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
检测器
固定相
❖ 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又 称为层析介质、层析填料、填充剂等。
❖ 包括：
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺
层析介质与生物大分子的关系
❖ 大孔径的，亲水性好的球形材料。 ❖ 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex Sepharose Bio-Gel
2、等电点沉淀
❖ 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。
层析介质的性能
❖ 层析介质的形状：球形，不定形 ❖ 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
❖ 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。
❖ 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
三、层析前蛋白质处理
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；
在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
检测器
固定相
❖ 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又 称为层析介质、层析填料、填充剂等。
❖ 包括：
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺
层析介质与生物大分子的关系
❖ 大孔径的，亲水性好的球形材料。 ❖ 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex Sepharose Bio-Gel
2、等电点沉淀
❖ 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。
第二章 层析技术
50
chromatography
⑶ 加样
通常加样量应少于20%的操作容量；
加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，
尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦；
51
chromatography
(4) 洗脱
简单洗脱
如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大， 其区带的洗脱时间间隔不长，适合采用该法。
醇、酚等）多采用反相色谱；
28
chromatography
7. 操作容量（或交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达 到平衡时，存在于基质上的饱和容量；
单位是mmol/g (mg/g) 或 mmol/ml (mg/ml)； 数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强； 同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的， 这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多 少、溶剂的性质等多种因素的影响；
库恩，德国生物化学家（1900-1967）。 库恩在研究中发现8种类胡萝卜素，并制 纯品，确定其化学结构；与卡勒阐明了 核黄素的结构，并首次提纯了1g核黄素； 与他人合作分离出维生素B6。1938年， 库恩因对类胡萝卜素和维生素的研究取 得成果而获得了诺贝尔化学奖。
3
chromatography
3. Martin和Synge的工作
展层剂的选择 样品预处理 点样 饱和与展层
显色(化学法,物理法)
Rf值测定 定量方法(洗脱比色法,斑点面积法)
31
chromatography
32
chromatography
33
chromatography
3. 影响纸层析迁移率Rf值的主要因素
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1. 选择
粒度选择表 用途 制备(分离) 分离常量元素 分离微量元素 篩孔 50 ~ 100目 100 ~ 200目 200 ~ 400目
2.处理
[过篩]:市售的树脂大小不一, 故应除去过大 过小的树脂颗粒. [除杂] : 市售的树脂含有杂质, 故应除去树脂 中 的杂质. 除杂方法:
3.离子交换剂的处理、再生和转型
粒径10-300m,分离大于3x104大分子, 流 速75cm/h, pH工作范围2-9.
Toyopeal系:如DEAE-Toyopea-650,
MonoBeads系:如Mono Q,粒径10m,
一、离子交换树脂的结构和性质 •（一）结构 • 离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分 子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于 酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被 交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树 脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。 • 1. 阳离子交换树脂 • 阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的 强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯 苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。 • 这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、 氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。
1)处理 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待 充分膨胀后即可进行处理。常规的处理步骤是， 加过量的水悬浮除去细颗粒，而后改用酸碱浸泡， 以便除去杂质并使其带上需要的反离子。在每次 用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性， 再用碱(或酸)处理。末了用水洗离子交换剂，可采用一定 的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫 再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处 理完成，但有时也可以借助转型处理完成。 所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转 到另一种反离子的过程，转型后的离子交 换剂会按使用要求带上一定种类的离子或 基团。总之，对离子交换剂的处理、再生 和转型的目的是一致的，即要求其带上使 用时所期望的离子或基团。
3. 装柱 示意图见下，可用滴定管代替。
a.润湿的玻璃丝塞在下端 （防止树脂流出）； b.柱子充满水；
c.倒入树脂（不可有气泡）；
d.盖一层玻璃丝（防止加入溶 液时把树脂层冲动）
（3）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡 离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强 度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质 如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物 质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待 分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大 的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂 有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交 换剂结合或结合不稳定。
根据离子交换剂的极性分：可分为疏水性
离子交换剂和亲水性离子交换剂。
疏水性离子交换剂中的基质是一种人工合成的、
与水结合力较小的树脂物质。常用的一类树脂是由苯
乙烯和二乙烯苯合成的聚合物。
亲水性离子交换剂中的基质是一类天然的或人工
的、与水结合力较大的物质。常用的有纤维素、交联
纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖等。
2.阴离子交换树脂 • 阴离子交换树脂与阳离子交换树脂具有同样 的有机骨架，只是所联的活性基团为碱性基团。 如含季胺(-N(CH3)3)的树脂的H+ 不易电离，称为 强碱性阴离子交换树脂，含伯胺基(-NH2)、仲胺 基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的树脂为弱碱性 阴离子交换树脂。这些树脂水化后分别形成RNH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH 和RN(CH3)3OH等氢氧型阴离子交换树脂，所联的 OH-可被阴离子交换和洗脱。 • 阴离子交换树脂的化学稳定性及耐热性能都 不如阳离子交换树脂稳定。
离子交换层析示意图
(三)交换 • 将试液加到交换柱上，用活塞控制一定的流 速进行交换。经过一段时间之后，上层树脂全部 被交换、下层未被交换，中间则部分被交换，这 一段称为“交界层”。随着交换的进行，交界层 逐渐下移，至流出液中开始出现交换离子时，称 为始漏点(亦称泄漏点或突破点)，此时交换柱上 被交换离子的物质的量数称为始漏量。在到达始 漏点时，交界层的下端刚到达交换柱的底部，而 交换层中尚有未被交换的树脂存在，所以始漏量 总是小于总交换量。
（2）装柱 先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤 压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交 换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的 交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和 气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶 2～3cm为宜；
(二)装柱 • 进行离子交换通常在离子交换柱中进行。离 子交换柱一般用玻璃制成，装置交换柱时，先在 交换柱的下端铺上一层玻璃丝，灌入少量水，然 后倾入带水的树脂，树脂就下沉而形成交换层。 装柱时应防止树脂层中存留气泡，以免交换时试 液与树脂无法充分接触。树脂高度一般约为柱高 的90%。为防止加试液时树脂被冲起，在柱的上 端亦应铺一层玻璃纤维。交换枝装好后，再用蒸 馏水洗涤，关上活塞，以备使用。应当注意不能 使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入 溶液时，树脂间隙中会产生气抱，而使交换不完 全。 • 交换柱也可以用滴定管代替。
• 各种阳离子交换树脂含有不同的活性基因、 常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚基(OH)等。根据活性基团离解出H+能力的大小不同， 阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如 含 - SO3 的 为 强 酸 性 阳 离 子 交 换 树 脂 ， 常 用 RSO3H表示(R表示树脂的骨架)，而-COOH和-OH 的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和ROH表示。 • 强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性 阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液 中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。
(二)性质
• 1．交联度 离子交换树脂的骨架是由各种有机原 料聚合而成的网状结构，例如强酸性阳离子交换树脂 的合成过程，是先由苯乙烯聚合而成为长的链状分子， 再由二乙烯苯把各链状分子联成立体型的网状体。这 里二乙烯苯称为交联剂，树脂中所合交联剂的百分率 称为重量交联度。如二乙烯苯在原料总量中占10%。 则称该树脂的交联度为10％。 • 树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大 的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择性： 另外，交联度大时，形成的树脂结构紧密，机械强度 高。但是如果交联度过大则对水的膨胀性能差(一般 要求1克干树脂在水中能膨胀至1.5-2cm3 为宜)，交换 反应的速度慢，因此要求树脂的交联度一般为4-14％。
二、离子交换层析
1.离子交换层析的原理 生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不 同的分子大小及电荷排列方式。离子交换剂是通 过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的 化学基团后的产物。可人为选择性地使其带有正 电荷或负电荷。当在一定pH下净电荷为负的蛋白 质分子可通过静电键结合到带正电荷的离子交换 剂(称为阴离子交换剂)上；反之，称为阳离子交 换剂。 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在 以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子 强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被 洗脱下来。
SO3H SO3H
SO3H
SO3H SO3H
SO3H
SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H SO3H
SO3H
SO3H
-SO3H：活性基团
：树脂基体
2. 交换容量 离子交换树脂交换能力的大小， 可用交换容量表示。理论上的交换容量是指 每克干树脂所含活性基团的物质的量，而实 际交换容量是指在实验条件下，每克干树脂 能交换离子的物质的量。显然交换容量的大 小取决于网状结构内所含活性基团的数目， 交换容量可通过实验测得。
特点：
1、分离效率高 2、应用范围广（无机、有机及高纯
物的制备）
3、树脂可反复使用（具有再生能 力） 4、操作烦，周期长
第一节、概论
无机离子交换剂的缺点：
1、交换能力低
2、化学稳定性差
3、机械稳定性差 有机离子交换剂的特点：
1、网状结构
2、难溶（水、酸、碱、有机溶剂）
3、稳（热、机械、化学）
4、含活性基团（-SO3H、-COOH、≡NOH）
离子交换色谱
(Ion Exchange Chromatography) 利用离子交换剂与溶液中的离子发生交换作用而 使离子分离的方法，称为离子交换分离法。20世纪初 期，工业上就开始用天然的无机离子交换剂泡沸石来 软化硬水。泡沸石的化学成分为硅铝酸盐(如 Na2A12Si4O12·nH2O)，当与水接触时，其中的Na+便 与水中的Ca2+、Mg2+发生交换作用： • Na2Z + Ca2+ ＝CaZ + 2Na+ 从而使水软化。但这类无机离子交换剂的交换能力低， 化学稳定性和机械强度差，应用受到很大限制。 • 近年来合成了有机离子交换剂——离子交换树脂， 基本上克服了无机离子交换剂的缺点因此离子交换分 离法在生产和科研各方面得到了广泛的应用。
3）转型 长期使用过的亲水性离子交换剂的
处理一般只用酸、碱浸泡即可。原则上讲，
去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结
构和稳定性，不影响其原有交换容量的前提
下进行。对于琼脂糖离子交换剂的处理是在
使前仅用蒸馏水漂洗、缓冲液平衡后即可。
其他亲水性离子交换剂的再生和转型操作和
琼脂糖离子交换剂的一样。
若需要特殊形式,可以用不同溶液处理。 例： +
葡聚糖系:如DEAE-Sephadex A-50, 琼脂糖系:如DEAE-Sepharose-6B,
粒径45-165m,排阻极限106, 流速 60cm/h, pH工作范围2-9. 粒径20 - 80m,排阻极限106,流速 300ml/h.cm2,pH工作范围2-9. 排阻极限107, pH工作范围3-11.
离子交换剂的性质及类型
离子交换剂的特点: 亲水性及生物相容性 离子交换剂的类型: 纤维素系:如DEAE-Sephacel,粒径