分子标记技术及其应用_ISSR
分子标记技术原理、方法及应用
分子标记技术原理、方法及应用一、遗传标记的类型及发展遗传标记（genetic marker)：指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性.它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。
形态学标记:主要包括肉眼可见的外部形态特征，如:矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。
优点：形态学标记简单直观、经济方便.缺点：(1）数量在多数植物中是很有限的; （2）多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁；(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长细胞学标记：植物细胞染色体的变异:包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等)的变化。
优点：能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；(2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。
分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型.优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小.缺点：（1)目前可使用的生化标记数量还相当有限；(2)有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异,也叫DNA标记。
（1）数量多，高多态性,信息量大(2）与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4）均匀分布于整个基因组（5）选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7）成本低廉(8)稳定,重复性好（9)共显性遗传在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记,包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记;第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记;第三类是一些新型的分子标记,如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
分子标记技术的原理和应用
分子标记技术的原理和应用1. 简介分子标记技术是一种用于标记和检测生物分子的方法。
通过在目标分子上引入特定标记物，可以实现对这些分子进行定量、定位及特异性检测。
本文将介绍分子标记技术的原理和应用。
2. 原理分子标记技术主要通过以下步骤来实现对目标分子的标记和检测：•选择标记物：标记物通常是具有特异性的分子或结构，如荧光染料、酶、金纳米颗粒等。
根据标记物的特性和应用需求，选择合适的标记物。
•引入标记物：将选定的标记物与目标分子进行结合。
这可以通过化学反应、酶促反应或物理吸附等方法实现。
•检测标记物：使用适当的检测方法，如光谱分析、电化学方法等，对标记物进行定量或定性检测。
这些方法可以根据标记物的特性和需求选择。
3. 应用分子标记技术在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：3.1 生物医学研究•免疫组织化学：通过标记特定抗体来检测组织中的蛋白质，用于研究疾病诊断、治疗反应和组织学研究。
•分子诊断：使用分子标记技术检测体液中的特定生物分子，如DNA、RNA和蛋白质，用于早期疾病诊断和个体化治疗。
•药物研发：利用分子标记技术对药物与靶标的相互作用进行研究，加速药物研发过程。
3.2 食品安全检测•农药残留检测：使用分子标记技术检测食品中的农药残留物，保证食品安全。
•食品成分分析：通过标记特定分子，检测食品中的成分和添加物。
3.3 环境监测•水质检测：使用分子标记技术检测水中的有害物质和污染物，保护环境和人类健康。
•大气污染监测：通过标记特定分子，检测大气中的污染物，评估空气质量。
3.4 基因组学研究•基因定位：使用分子标记技术对基因组中特定序列进行定位和研究。
•基因表达分析：通过标记RNA或蛋白质，研究基因在各个组织中的表达情况。
4. 总结分子标记技术以其高灵敏度、高特异性和高可视性等优势，在生物医学研究、食品安全检测、环境监测和基因组学研究等领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，相信分子标记技术将在未来发挥更大的作用，并为各个领域的研究和应用带来更多的突破。
ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用_朱岩芳
[11]Chau D T.Correlati on bet ween lea f stand ,l ea f area i ndex andy ield in the m a ize -hybrids representi ng the l ast 20years[J].N oveny ter m eles ,1993,42(1):1-10.[12]曹靖生.几个玉米株型性状的遗传规律研究[J].黑龙江农业科学,1995(3):16-19.[13]张泽民,贾长柱.玉米株型对遗传增益的影响[J].遗传,1997,19(2):31-34.[14]李玉玲,黄西林,席章营,等.玉米株型与穗粒性状同步改良的数量遗传基础研究[J].河南农业大学学报,1996,30(4):319-323.[15]李玉玲,苏祯禄,孙书库,等.玉米株型性状的配合力及其相关研究[J].河南农业大学学报,1994,28(4):354-360.[16]张彪,陈宛秋,唐继伟,等.玉米自交系株型性状配合力分析及应用[J].四川农业大学学报,1994,12(3):438-442.[17]张彪,张启行,兰发盛.玉米几个自交系组配高产紧凑型杂交种的研究[J].玉米科学,2000,8(3):33-36.[18]M ason L ,Zuber M S .Corn leaf or ientation effects on li ght i n -tercepti on ,i ntraspecific com petition ,and gra i n y i e l ds[J].Jour -na l of Producti on A g ricu lture ,1999,12(3):396-399.[19]温海霞,蔡一林,王久光,等.9个玉米自交系主要株型性状的配合力分析[J].西南农业大学学报,2002,24(3):223-225.[20]陈岭,崔绍平,徐有,等.玉米株型性状的遗传分析[J].华北农学报,1994,9(增刊):11-15.[21]王秀全,陈光明,刘昌明,等.玉米株型育种亲本选配的遗传规律研究[J].西南农业学报,2000,13(1):50-54.[22]王国强,蔡一林,王久光,等.10个玉米自交系株型性状的配合力分析[J].西南农业大学学报,2005,27(3):374-377.[23]张兴端,霍仕平,向振凡,等.玉米重组群体株型性状和生物学特性的遗传潜势与杂种优势研究[J].西南农业学报,2005,18(6):675-679.收稿日期:2009-10-23基金项目:浙江省重大科技专项(优先主题)(No .2008C 12005-1)、农业部转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX 08005-005)和云南省烟草公司项目(09YN 008)资助。
ISSR标记技术及其在遗传多样性研究中的应用
ISSR 标记技术及其在遗传多样性研究中的应用谢佳燕 张知彬3(中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理国家重点实验室,北京,100080)摘要:ISSR (Inter 2S imple Sequence Repeat )技术是在PCR 中直接使用微卫星序列进行DNA 扩增的一种DNA 分子标记。
文章主要介绍了ISSR 标记的原理、方法、特点及其在遗传多样性研究中的应用。
ISSR 标记方法具有无需知道任何靶标序列的微卫星背景信息、遗传多态性高、检测快速等特点,在遗传多样性研究中具有广泛的应用前景。
关键词:ISSR 技术;应用;遗传多样性中图分类号:Q751 文献标识码:A 文章编号:1000-1050(2004)01-0077-07I nter 2Simple Sequence R epeat and Applicationin the R esearch of G enetic DiversityXIE Jiayan ZH ANG Zhibin(State K ey Laboratory o f Integrated Management o f Pest Insect and Rodentsin Agriculture ,Institute o f Zoology ,the Chinese Academy o f Sciences ,Beijing ,100080)Abstract :The purpose of this review is to introduce principles ,methods ,characteristics and applications of a new DNA marker ,inter 2simple sequence repeat (ISSR ),which inv olves the use of microsatellite sequences directly in the polymerase chain reaction (PCR )for DNA amplification 1ISSR using SSR -based primers is a very useful system for efficient retrieval and analysis of genetic in formation in eukary otes 1The ISSR technique tests fast ,requires very little genomic sequence data and screens s o many polym or 2phisms in an assay 1The advantages of ISSR should make this marker system used widely in the research of genetic diversity 1K ey w ords :ISSR ;Application ;G enetic Diversity 近年来,随着分子生物学的迅速发展,DNA 分子标记技术广泛地应用于群体遗传多样性和保护生物学的研究,如限制性片段长度多态(RF LP )、随机扩增多态性(RAPD )、微卫星(Microsatellite )和扩增限制性片段长度多态分析(AF LP )等[1～8]。
ISSR分子标记及其在植物遗传育种中的应用
了Ｒ Ｐ Ａ Ｄ和 Ｓ Ｒ的优 点 ，具 有模 板 需要 量 少 、 ｍａｔｌ ９ ８ 。 Ｋ ｊ ｅａ， ９ ） ｉ １ ＩＳ ｉｔ － ｉ ｐｅｓｑ ｅ ｃ ｅ ｅｔ又称 简单 Ｓ Ｒ（ｎｅ ｓ ｌ ｅ ｕ ｎ ｅｒｐ ａ） ｒ ｍ 重复 序列 间 扩增 。 在 Ｓ Ｒ基础 上 发展 起来 的一 是 Ｓ
肖海 峻 １ 孟 利前 ’ 李 玉冰 ’ ， ２ 。
（ ． 京 农 业 职 业 学 院 ， 京 １２４ ；． 国 农 业 科 学 院 草 原 研 究 所 ． 蒙 古 呼 和 浩 特 １ 北 北 ０ ４ ２２中 内 ００ １） １０ ０
摘 要 简单 重 复 序 列 闻 扩 增 （ Ｓ ￣ 术 以 其 丰 富 的 多 态性 、 显 性 遗 传 、 Ｉ Ｒ） Ｓ 共 重复 性 好 、 作 简 单 、 物 设 计 简 操 引
种 特 点 ， 出现 了 ｓ Ｒ和 ＩＳ 才 ｓ Ｓ Ｒ技 术 。ＩＳ Ｓ Ｒ是 基
于 Ｓ Ｒ发 展起 来 的一 种新 型分 子标 记技 术 ， 的 Ｓ 它
Ｒ Ｐ 、 卫 星 （ ｃｏａｅｌｅ 或 称 简 单 序 列 重 Ａ Ｄ） 微 ｍｉ ｓｔｌｔ） ｒ ｉ
复 （ｉ ｌ ｅ ｕ ｎ ｅ ｅｅ ｔ Ｓ 、 增 片 段 长 度 ｓ ｅ ｑ ｅ ｃ ｒｐ ａ， Ｒ） 扩 ｍｐ ｓ Ｓ 多 态 性 （ｍ ｌｉｄｆ ｇ ｎ ｅ ｇｈ ｐｌｍ ｒｈｓ ａ ｐｉｅ ｒ ｍｅｔｌｎ ｔ ｏ ｏｐ ｉ ｆ ａ ｙ ｍ，
子 标记 育 种 等方 面 。
１ ＩＳ Ｓ Ｒ技 术原 理 及 特点
与 其 他 基 于 Ｐ Ｒ 技 术 的 分 子 标 记 方 法 一 Ｃ
出现 ， 于 Ｐ Ｒ技 术 的 分子 标 记 ， 随机 扩 增 多 基 Ｃ 如
分子标记-RAPD和ISSR
二、基于PCR技术的分子标记 二、基于PCR技术的分子标记
随机扩增多态性DNA（ 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple Sequence Repeat， ）、简单重复序列 Repeat， SSR) 、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length 扩增片段长度多态性(Amplified Polymorphism， Polymorphism，AFLP )、ISSR（ inter-simple )、ISSR（ intersequence repeat ）
ISSR DNA-PCR扩增结果（示例）： 扩增结果（示例）： 扩增结果
ISSR引物 U807对两种铁皮石斛的扩增结果
ISSR引物 U826对两种铁皮石斛的扩增结果
分子标记类型
现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 标记技术已有几十种 一、基于分子杂交的分子标记 这类标记利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同 生物体的DNA分子 然后用特异探针进行杂交， 分子， 生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放 射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性 的多态性。 射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。 （一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment 限制性片段长度多态性（ Length Polymorphism，RFLP） Polymorphism，RFLP） 小卫星DNA（ DNA） （二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）
RAPD (random amplified polymorphic DNA） ）
分子标记技术及其应用
Right primer
分子标记技术及其应用
SBE1 CAPS marker derived from 3’-end was used to detect SBE1 gene in DH lines
分子标记技术及其应用
SCAR标记
分子标记技术及其应用
Hale Waihona Puke 1.2 基于PCR技术的分子标记
简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR）或称微卫星DNA（Microsatellite Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。 –在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序
分子标记技术及其应用
1.2 基于PCR技术的分子标记
随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD 技术
–是由Williams和Welsh（1990）同时发展起 来的一项遗传标记技术。RAPD一般采用10个 核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度 降至35℃左右。
分子标记技术及其应用
RAPD标记
分子标记技术及其应用
RFLP Based on the mutations
分子标记技术及其应用
RFLP
分子标记技术及其应用
分子标记技术及其应用
ISSR分子标记及其应用
安徽 农 学通 报 ， ｎ ｕ ｇｉＳｉＢ ｌ ２０ ，４ １ ） Ａ ｈｉ ｒ ｃ． ｕ１ ０ ８ １ （ ９ Ａ ． ．
４ ５
ＩＳ Ｓ Ｒ分 子 标 记 及 其 应 用
罗海燕 陈业渊
（ １中 国热 带 农 业 科 学 院热 带 作 物 品种 资源 研 究所 ， 南 儋 州 ５ １３ 海 ７７７
中 图分 类号
Ｑ ４ ３１
ห้องสมุดไป่ตู้
文献标识码
Ａ
文章编号
１０ ７ ３ （０ ８ １ ４ ０ ０ ７— ７ １ ２ ０ ）９— ５— ２
Ｉ Ｒ ｏ ｅ ｕｌ ｒ Ｍ ａ ｋｅ ｎ ｉｓ Ｕｓｎｇ ＳＳ Ｍ ｌ ｃ ａ ｒ ｒ ａ ｄ ｔ ｉ
Ｌ ｏＨａｙ ｎ ｅ ａ． （ ｒｐｃｌＣ ｏ ｓ Ｇ ｎ ｔ ｅｏ ｒｅ Ｉｓ ｔｔｓ Ｃ ｉｅｅ Ａ ａ ｅ ｙ ｏ ｒｐｃ ｌ ｇｉ ｌ ｒ Ｓ ｉ ｃ ｓ ｕ ｉ ｔ １ ａ １ Ｔ ｏ ｉ ｒｐ ｅ ｅ ｃ Ｒ ｓｕｃ ｓ ｎｔ ｕｅ ， ｈｎ ｓ ｃ ｄ ｍ ｆ ｏ ｉａ Ａ ｒ ｕｔ ｅ ｃ ｎ ｅ ， ａ ｉ ｉ Ｔ ｃ ｕ ｅ
２中国热带农业科 学院 ， 南儋州 海
５ １３ ） ７ ７ ７
摘
要 ： 文 简述 了 ＩＳ 本 Ｓ Ｒ分 子 标 记 的 原 理 、 本 操 作 程 序 ， 绍 了 ＩＳ 分 子 标 记 技 术 反 应 条 件 的 选 择 及 其 在 遗 传 多 基 介 ＳＲ
样性 分析等方面的应用 。
关 键 词 ：Ｓ Ｒ； 子 标 记 ； 用 ＩＳ 分 应
重复 性好 、 异性 高 的引物 ” 。合适 的引物 浓度 不仅 可 以 特 保证 整个 Ｐ Ｒ反应 成功 ， Ｃ 而且在 提 高 产物 的特 异性 、 除 消 背景 、 消除杂 带方 面引 物浓 度也 起非 常重 要 的作用 。
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ISSR分子标记技术在果树遗传学的应用
• 遗传多样性和居群遗传结构
• 种质资源பைடு நூலகம்定与亲缘关系 • 遗传指纹图谱的构建
遗传多样性
• 彭瑜等利用ISSR分子标记方法对20个柚类 品种进行遗传多样性研究，揭示了柚类品 种间丰富的遗传多样性。 • 邹游等利用ISSR技术对采自四川省猕猴桃 科研基地的14个猕猴桃品种进行了遗传多 样性分析。ISSR标记说明猕猴桃品种间遗 传距离与地理分布有一定关系, 地理位置 较近的品种能聚在一起。
• SDS法
• CTAB法
引物设计
• 引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。 用于ISSR的引物常为5＇端或3＇端加锚的二核苷 酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数一 般为4～8次，使引物的总长度达到20bp左右。5＇ 端或3＇端用于锚定的碱基数目一般为1～4个，锚 定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配 SSR的一端结合，而不是中间，从而对基因组中特 定片段进行扩增、检测。
缺点
PCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸
索。 ISSR标记大多是显性标记，不能区分显 性纯合基因型和杂合基因型。
ISSR分子标记实验操作
• DNA样品的提取
• 引物设计
• PCR扩增反应
• PCR产物的电泳及数据分析
DNA样品的提取
提取植物DNA的方法有很多，用于ISSR分子标
记的DNA样品的提取方法有：
（anchored simple sequence repeat，ASSR），也称作 简单重复间序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)标 记技术或以微卫星为引物的PCR(microsatellite primed PCR,MP-PCR) 。 它是由加拿大蒙特里尔大学的Zietkiewicz等1994年提 出的 。
ISSR分子标记的基本原理和特点
• 基本原理
• 特点
基本原理
在真核生物基因组中均存在着由1～4个核苷酸组成的简单 重复序，如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因组
中最多的SSR 是(AT)n、(TA)n、( GA)n、(CT)n等二核苷酸重
复序列。ISSR技术的基本原理就是在用锚定的微卫星DNA为引 物，即在SSR序列的3ˊ端或5ˊ端加上2～4个随机核苷酸，在 PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引 物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。
Thank you!
PCR扩增反应
反应体系 • 模板DNA • dNTP • 引物 • Taq DNA聚合酶 • PCR反应缓冲液
扩增步骤
• 变性（denaturation） • 退火（anealing） • 延伸(extension)
PCR产物的电泳与数据分析
•
•
PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行 条带观察、统计。
目前可用于ISSR扩增产物分离的电泳有：浓度 为1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳或浓度为6%聚丙 烯酰胺凝胶电泳，后者的分离效果通常更好。用 溴化乙锭(EB)或硝酸银染色后，在紫外光或可见 光下进行观察，统计带纹的有(计为1)或无(计为O) 及相对位置，然后即可根据研究目的，应用 UPGMA、SPSS等聚类分析软件进行分析。
• Sankar等对用ISSR在柑橘作图中效果评价，认为 ISSR 标记符合孟德尔式分离，标记是显性标记，少 部分标记呈共显性分离， 可以同RFLP、RAPD、同工 酶的遗传图谱相互补充，构建新的遗传图谱，因此 ISSR适合柑橘的遗传图谱构建。 • 雷天刚等利用SSR标记和ISSR 标记对102个柑橘栽培 品种进行DNA指纹分析，筛选适合的特征引物，构建 柑橘栽培品种的指纹图谱数据库。
代表的4个柑桔品种。
基于ISSR分析的14份南丰蜜桔UPGMA聚类图
种质资源鉴定与亲缘关系
•
果树生命周期长，并长期通过无性方式繁殖，加上不 同地域间的相互引种，使同名异物和同物异名现象十分普 遍，如何准确地对现有果树品种鉴定和亲缘关系分析，是 进一步科学、有效地利用果树资源的基础。借助ISSR分子 标记技术，可以在大范围内对果树的遗传物质进行较全面 的比较，从而对果树种质资源鉴定和亲缘关系分析。 吴兴恩等对富民枳、枳、枳橙和甜橙等22份柑桔资源 进行了ISSR分析,并对所得结果进行了讨论，发现采用 ISSR技术可作为品种鉴别、亲缘关系和分类的手段之一。
ISSR分子标记及其在果树遗传 学的应用
果树学 刘志发
主要内容
• ISSR分子标记 • ISSR分子标记的基本原理和特点
• ISSR分子标记实验操作
• ISSR分子标记在果树遗传学的应用 • 问题与展望
ISSR分子标记
ISSR分子标记是在SSR分子标记基础上发展起来的
一种DNA多态性检测技术。即锚定简单重复序列
5′锚定引物 NNNN(CA)n
3′锚定引物 NN(CA)n
锚定ISSR-PCR示意图
CACACACACACACACA
GTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGT
GTGTGT GTGTGTGTGT
CACACACACACACACACACACACACACA
3′锚定引物 NN(CA)n
3′锚定引物的PCR产物
5′锚定引物 NNNN(CA)n
5′锚定引物的PCR产物 用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5′端或3′锚定1至数个碱基。
ISSR的特点
优点： 实验操作简单、快速、高效，DNA用量少,引 物设计容易,实验成本低廉。 ISSR遗传多态性高，重复性好。 符合孟德尔遗传规律。 无需知道任何靶标序列的SSR背景信息。
问题与展望
• ISSR标记因其引物容易设计，实验重复性强，操作过程 简单，不须使用同位素，可以揭示更高程度的DNA多态性， 从而在果树遗传研究中具有广阔的应用前景，但任何一种 分子标记都不能解决所有问题，在今后的研究工作中，我 们应根据自己的研究目的，选择合适的分子标记，或将不 同标记结合起来进行综合研究。ISSR标记存在一些缺点, 限制了其在某些方面的应用。 • ISSR标记以其多态性高、可重复性强、简便快速等优势, 必将使其在果树种质鉴定、系统发育研究、育种材料早期 选择等方面发挥更大的作用。
• 徐志祥等ISSR分子标记对南丰柑桔品种的遗传多样 性进行研究。从100个ISSR引物中筛选出17个多态引
物，对14份柑桔样品进行ISSR-PCR分析。UPGMA聚类
分析结果表明，以遗传相似系数为0.67为分界线， 可以将14份供试柑桔样品分成三类：第一类包含以 ss-28为代表的7个柑桔品种；第二类包含以杨小2,6 为代表的3个柑桔品种；第三类包括以早系97-1 为
遗传指纹图谱的构建
• 果树遗传指纹图谱研究技术是在现代仪器分 析技术基础上发展起来的, 进而对果树进行鉴定 和质量控制。研究方法也有多种, 分别从不同的 角度反映了果树的遗传信息。ISSR标记容易发现 多态性，敏感性高，通过ISSR分析可以找出与靶 基因连锁的ISSR标记。ISSR标记在杂交群体中呈 孟德尔式分离，ISSR遍布基因组，多态性高，因 此可用于遗传作图。