3-分子标记技术原理、方法及应用
分子标记技术的原理和应用
分子标记技术的原理和应用1. 简介分子标记技术是一种用于标记和检测生物分子的方法。
通过在目标分子上引入特定标记物，可以实现对这些分子进行定量、定位及特异性检测。
本文将介绍分子标记技术的原理和应用。
2. 原理分子标记技术主要通过以下步骤来实现对目标分子的标记和检测：•选择标记物：标记物通常是具有特异性的分子或结构，如荧光染料、酶、金纳米颗粒等。
根据标记物的特性和应用需求，选择合适的标记物。
•引入标记物：将选定的标记物与目标分子进行结合。
这可以通过化学反应、酶促反应或物理吸附等方法实现。
•检测标记物：使用适当的检测方法，如光谱分析、电化学方法等，对标记物进行定量或定性检测。
这些方法可以根据标记物的特性和需求选择。
3. 应用分子标记技术在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：3.1 生物医学研究•免疫组织化学：通过标记特定抗体来检测组织中的蛋白质，用于研究疾病诊断、治疗反应和组织学研究。
•分子诊断：使用分子标记技术检测体液中的特定生物分子，如DNA、RNA和蛋白质，用于早期疾病诊断和个体化治疗。
•药物研发：利用分子标记技术对药物与靶标的相互作用进行研究，加速药物研发过程。
3.2 食品安全检测•农药残留检测：使用分子标记技术检测食品中的农药残留物，保证食品安全。
•食品成分分析：通过标记特定分子，检测食品中的成分和添加物。
3.3 环境监测•水质检测：使用分子标记技术检测水中的有害物质和污染物，保护环境和人类健康。
•大气污染监测：通过标记特定分子，检测大气中的污染物，评估空气质量。
3.4 基因组学研究•基因定位：使用分子标记技术对基因组中特定序列进行定位和研究。
•基因表达分析：通过标记RNA或蛋白质，研究基因在各个组织中的表达情况。
4. 总结分子标记技术以其高灵敏度、高特异性和高可视性等优势，在生物医学研究、食品安全检测、环境监测和基因组学研究等领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，相信分子标记技术将在未来发挥更大的作用，并为各个领域的研究和应用带来更多的突破。
第五章分子标记技术原理与应用
AFLP标记的基本原理是基于PCR技术扩增基因 组DNA限制性片段，基因组 DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头 连接到DNA片段的末端，接 头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结 合位点。限制性片段用两种 酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用 切割酶。
分子标记的应用
获得与目标性状连锁的分子标记
分子标记辅助育种的经典例子
美国科学家将分子选择应用在玉米杂种优势遗传改良上，经过改良的B73 改良的Mo17的组合比原始的B73 Mo17组合和一个高产推广组合 Pioneer hybrid 3165皆增产10%以上（Stuber and Sisco 1991; Stuber et al. 1995）。 通过分子标记技术将3个抗稻瘟病基因（Pi-2、Pi-1和Pi-4）在水稻第6、 11和12号染色体上进行定位，然后利用连锁标记将这3个抗性基因聚合起 来。基因聚合试验从3个分别带有Pi-2、Pi-1和Pi-4基因的近等基因系 C101LAC、C101A51和C101PKT出发，已成功地获得聚合了这3个抗稻瘟病 基因的植株，它们可以作为供体亲本在育种中加以利用，可同时提供数 个抗性基因。 （Zheng et al. 1995）
一、限制性片段长度多态性技 术(RFLP)
限制性片段长度多态性技术(RFLP)是用已知的 限制性内切酶消化目标 DNA，电泳印迹，再用DNA探针杂交并放射自 显影，从而得到与探针同源 的DNA序列酶切后在长度上的差异。 RFLP标记在正常的分离群体中都呈典型的孟德 尔式遗传。PFLP的结果稳 定，在作物基因图谱构建和QTL基因定位分析 上使用较多。
三、简单重复序列SSR
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
分子标记技术原理方法及应用
分子标记技术原理方法及应用分子标记技术是一种用于检测和定位特定分子的方法。
其原理是通过将一种特殊的化学物质（标记物）与目标分子结合，然后利用标记物的性质来对目标分子进行分析和检测。
分子标记技术被广泛应用于生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域。
常用的分子标记技术有荧光标记、酶标记和放射性标记等。
荧光标记是一种将目标分子与荧光染料结合的技术。
荧光标记的原理是通过荧光染料的特性，使得目标分子在荧光显微镜下显示出特定的荧光信号，从而对其进行定位和分析。
荧光标记可以在细胞、组织和体内进行，具有灵敏度高、分辨率高和实时监测的优点。
常见的荧光标记方法有间接免疫荧光标记、原位杂交荧光标记和荧光蛋白标记等。
荧光标记技术广泛应用于细胞定位、蛋白质相互作用研究、细胞分析和分子诊断等领域。
酶标记是一种利用酶与底物反应的方法进行分子标记。
通常，酶标记将目标分子与特定的酶（如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）结合，然后通过对底物的催化作用产生显色或荧光信号。
酶标记在生物学检测中得到广泛应用，特别是在酶联免疫吸附试验（ELISA）中。
酶标记具有灵敏度高、稳定性好的特点，可以用于检测蛋白质、核酸和小分子等生物分子。
放射性标记是利用放射性同位素与目标分子结合的技术。
放射性同位素具有高灵敏度和长时间半衰期的特点，可以用于追踪和测定目标分子的存在和分布。
放射性标记技术广泛应用于细胞和分子影像学、放射性定位和药物代谢等领域。
分子标记技术在生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域有着广泛的应用。
在生物医学研究中，分子标记技术可以用于研究细胞和分子的结构和功能，探索疾病的发生机制和药物的作用机理。
在生物学检测中，分子标记技术可以用于检测和定位特定的生物分子，如蛋白质、核酸和小分子等，从而实现对生物过程的观察和分析。
在药物研发中，分子标记技术可以用于筛选和评价药物的活性和毒性，以及研究药物的代谢和药理学特性。
总之，分子标记技术的发展和应用为生物医学研究和生物学检测提供了强大的工具，有助于我们深入理解生命的奥秘和开发有效的治疗手段。
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
三代遗传标记
三代遗传标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲，都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异.每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围，但就一般意义而言，DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比，具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组.④多态性高，自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品，在适宜条件下可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利.因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1。
1 第1 代分子标记1.1。
1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化.优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠，重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时，需要该位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化.另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高，RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。
植物学中的分子标记技术及其在新品种选育中的应用
植物学中的分子标记技术及其在新品种选育中的应用一、引言植物育种是种子工业的重要部分，通过选择优良的品种来改善植物物种的性状，以适应不断变化的环境和市场需求。
然而，这一过程需要长期的精心筛选和育种设计，通常需要十年甚至更长时间。
为了加速育种进程，利用分子标记技术进行新品种选育已经成为了一种可行的选择。
二、分子标记技术1.基础知识分子标记是指可以在植物的DNA序列上特异地识别出某些区域，从而在需要的地方插入一个标记的技术。
分子标记可以嵌入到复杂的DNA序列中，成为一个容易检测的标记。
分子标记根据其类型和位置可以分为多种形式，如：电泳分子标记、PCR分子标记、核酸序列标记、序列标记和SNP标记等。
2.技术应用分子标记技术被广泛应用于新品种选育过程中。
其主要应用包括：(1)繁殖上的选择：利用特定的分子标记可以判定材料的遗传状况，优选选择优良材料进行选育；(2)品种鉴定：通过检测植物的老化性状，核酸序列和基因芯片，判定其真伪和物种类型；(3)人工杂交及杂种后代筛选：通过分子标记技术，可以快速鉴定新型杂交品种的基因亲缘关系，为繁殖和选择奠定基础。
三、分子标记技术在植物新品种选育中的应用1.杂交育种的应用杂交育种是培育植物新品种的一种主要方法。
通常，杂交育种需要配对双亲进行杂交，从而创建与父本之间具有特定遗传特征的后代。
不过，这个过程很容易出现不良杂种后代，使得选育时间被推迟或者失败。
分子标记技术可以解决这个问题。
在选育过程中，利用分子标记技术可以快速筛选出优良的后代，加速育种进程。
2.温室培育的应用温室培育是培育新品种的另一种主要方法。
温室环境的控制使得植物的生长环境更加稳定，可以加速植物的生长速度和增加产出。
然而，受限于环境因素，植物的生长速度还是比较慢的。
分子标记技术可以在温室环境中提高植物的生长速度和质量。
通过检测植物DNA上的分子标记，可以在温室环境下快速筛选出具有高产量和适应性的新品种，为新品种育种提供基础素材。
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细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染 色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等） 和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长 时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细 胞学方法进行检测
生化标记
主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从 组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法 将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影 响较小
缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相 当有限; (2)有些酶的染色方法和电泳技术有一 定难度
分子标记
主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种 差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA 间的差异，也叫DNA标记。
2/片段迁移率的变化要反映分子量的差异 ————DNA在聚丙烯酰胺凝胶上迁移率也受构象 变化影响
RFLP 基 本 步 骤
RFLP patterns in Pinus densata
RFLP
优点: 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响
共显性，非常稳定 起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制
分子标记技术原理、方法 及应用
黄健子 2011.10
一、遗传标记的类型及发展 二、几种常见分子标记的原理及方法 三、分子标记技术的应用
一、遗传标记的类型及发展
遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染
色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一 种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和 可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变 型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标 记、生化标记和分子标记四种类型。
RFLP
PCR-RFLP
➢ 实验流程
➢ DNA提取 ➢ 目的片段扩增(nrDNA, cpDNA or mtDNA 1–3kb) ➢ 限制性内切酶消化 ➢ 电泳分离 ➢ EB染色或银染
RFLP
BspI RsaI HincII
PCR-RFLP
ScaI MboII RsaI
Identification of rice genomes by PCR-RFLP of Adh genes
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文缩写 RFLP STS RAPD AFLP SSR SNP
英文名称
Restriction fragment Iength polymorphism
Sequence tagged site
Random amplified polymorphic DNA
Amplified frangment length Polymorphism
(1)数量多，高多态性，信息量大 (2)与生长发育无关，取材不受限制 (3)能明确辨别等位基因 (4)均匀分布于整个基因组 (5)选择中性，不影响目标性状的表达 (6)检测手段简单、快速 (7)成本低廉 (8)稳定，重复性好 (9)共显性遗传
在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经 发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技 术大致可以分为三大类：
缺点：检测步骤多，周期长，需DNA量大，费时
用作探针的DNA克隆制备、保存不方便 放射性同位素，易造成环境污染
自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、 大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP
RFLP研究的发展
酶 基因组DNA
切
对
象
PCR产物
RFLP PCR-RFLP
Simple sequence repeat
Simple mucleotide polymorphism
中文名称 限制性片段长度多态
性 序列标签位点 随机扩增多态性DNA
扩增片断长度多态性
简单序列重复 单核苷酸多态性
二、几种常见分子标记的原理及方法
1.RFLP 2.RAPD 3.AFLP 4.SSR 5.ISSR 6.SNP
形态学标记
主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、 紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖 特性、抗病虫性等有关的一些特性。
优点: 形态学标记简单直观、经济方便 缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标 记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通 过诱变、分离纯合的过程，周期较长
用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子 上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上 碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反 映在酶切片段的长度和数目上。
RFLP 分 子 基 础
RFLP
两个假设：
1/片段式样的变化由任一序列突变引起 ————DNA序列甲基化会造成酶切位点得失的假 象
第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA 指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性 RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序 列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标 签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism by Botstein(1980)
基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下， 产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的 DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从 而构建出多态性图谱。
Ge et al. 2001. Genome 44: 1136-1142
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA by Williams et al.(1990)
基本原理：此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有 10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进 行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反 向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一 引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩 增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间 DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和 长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过 EB染色以检测DNA片段的多态性。