如何解决细胞培养中的支原体污染
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施
生长 可证 明该 细胞受 到 了细菌 的污 染 。 １２ 支原 体 污 染 ． 支 原 体 污 染 不 能 用 肉眼 或 光 学显 微镜 检查 细胞观 察 出来 ， 带有 一 定的 隐蔽 性 ， 易被 人们忽 视 。 当细胞 被支 原体 污染 后 ， 细胞营 养 液可 能毫无 变 化 ，短 期 内细胞 没 有 明显 的病理 变
性 作用 ，因此 特 别要注 意不 同的细胞 培养 的特 点
培养 基上培 养 ， 如果见 到培养 基上 有霉 菌 生长 ， 也 可 以判 断该 细胞 受到霉 菌污 染 。霉 菌 污染 可 以使
细胞变 形 、 脱落 。霉菌孢 子对 环境 的耐 受 力很强 ，
和 对抗 生素 耐受程 度 的不 同。在对 具 体 的细胞选
种 营养 成分 隐性污 染细菌 没有 被检 测 出来所 造 成 的。 即使在 细胞培 养液 中加 入 了抗菌 素 ， 得细 菌 使
繁殖 处于 抑制状 态 ， 细胞 生长 不受 明显 影 响， 易 不
即淘汰 该细 胞和 培养 液 。 外 ， 此 支原 体污 染还可 用
荧光 染色法 ［ 和相 差显 微镜 观察 法 ［ 检测方 法 。 ｓ 等 １３ 霉菌 污染 ． 霉 菌污 染和 细 菌污 染 比较 相似 ， 都 可 以 由无 菌操 作环 境差 或者 器材 等 消毒 不彻底 造 成 。霉菌 污染 经 常发 生在潮 湿 的季节 或 者潮湿 的操 作环境 。可 以通 过 肉眼观 察细 胞 生长和 培养 基 培养 的方 法来检 测 霉菌 污染 。霉 菌短 期 内不会 引起 营 养液 的浑浊 ，但 是在 细胞 瓶壁 可 以见 到 明
广 东畜牧兽 医科技
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一
经验交流 ・９ ４・
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
细胞支原体污染怎么办？该怎么处理？
甲：细胞里突然出现小黑点，问君能有几多愁?乙：珍贵的细胞萎靡不振，扔了重买?相顾无言，惟有泪千行。
丙：细胞转染效率极低，实验结果遥遥无期，我的课题前功尽弃!但见泪恨湿，不知心恨谁!细胞培养中，最怕的就是生物污染，支原体污染就是其中的一种。
支原体这种微小的微生物，是细胞培养中令人头疼的大问题。
支原体结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。
支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。
支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。
污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。
支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。
例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。
无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。
支原体污染在细胞培养中实际上是比较常见的，可达30%甚至更高。
支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。
定期检测支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。
一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。
将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
预防支原体污染的建议：细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理抗血清处理抗生素加抗血清和补体联合处理支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
(一)污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
阳性阴性支原体污染4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
细胞出现小黑点是什么,支原体污染怎么办
细胞出现小黑点是什么，支原体污染怎么办炎炎夏日，细胞污染严重，它们正在被这越来越热的天气“折磨”。
你会慢慢发现细胞出现了一些不知何物的小黑点那些讨厌的小黑点到底是什么呢？今天我们就来说道说道吧~1.细胞碎片细胞生长状态不好，吹打过多或者多次吹打导致碎片，加大血清浓度，降低离心速度养两代试试。
碎片一般会离心出去。
这就是细胞碎片2.黑胶虫黑胶虫污染，黑胶虫一般小而且密。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡。
3.支原体污染支原体污染不易发现，很多细胞即使支原体污染，在没有出现猛烈爆发时细胞形态也不会有明显的变化，因此支原体污染经常被人们所忽视。
但是支原体污染对细胞的伤害比人们想象的要大得多，会直接对您的实验结果产生影响，包括以下几个方面：①严重降低细胞的基因转导效率:无论是病毒载体还是脂质体介导的基因转导，细胞都会因为支原体的污染而导致效率低下。
②严重影响细胞的功能表型:支原体严重影响细胞的分化方向，扰乱细胞的增殖、活力与代谢水平，造成实验中极其不稳定的细胞表型结果。
那么出现这些情况之后细胞怎么“自救”呢对于细胞支原体污染，向已经污染支原体的细胞中加入汉恒自主研发特效抗支原体试剂SaveIt™ 后，再用PCR检测培养细胞的支原体，电泳图如下。
结果显示，加入汉恒生物抗支原体试剂后，污染的支原体被有效清除。
虽然有试剂可以帮我们清除支原体，但是既然存在支原体污染那就说明别的地方是存在污染可能性的，例如生物安全柜，工作台，培养箱等等，对于这些情况，我们又可以怎么去解决呢？“喷一喷”汉恒生物SaveIt™抗支原体喷雾预防支原体污染效果显著，可用于生物安全柜、超净工作台、CO2培养箱、显微镜等常用仪器以及细胞房门把手等易污染的死角的消毒中，只需轻轻一喷，就可让您远离支原体污染带来的烦恼。
所以汉恒生物不仅有细胞“自用”的抗支原体试剂，还有“外用”的抗支原体喷雾。
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
细胞培养污染的途径、危害及预防措施
细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。
由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。
某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。
由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。
随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。
此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。
因此，熟悉细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。
1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。
细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。
每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。
同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。
为了保证培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。
具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。
经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。
培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。
随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。
应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。
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如何解决细胞培养中的支原体污染？
一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。
细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。
除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。
据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。
早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。
怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。
狡猾的支原体
支原体是唯一一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。
由于它的直径小（约为0.15-2 µm），而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。
支原体的种类非常多，超过了100种。
当然，大部分支原体检测都不可能检测到所有的种类。
不过，在实验室中捣乱的支原体也通常就是那一小撮。
支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。
然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。
细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。
传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。
这也就是支原体感染率高企的主要原因。
曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是25-60%的细胞系都感染了支原体。
”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。
怎么办？
检测、检测、再检测
对培养物进行常规的支原体检测非常重要。
尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。
比如美国国立细胞培养中心（NCCC），它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。
一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。
如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。
当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。
检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。
到底是PCR、生化分析、ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：灵敏、特异、快速、廉价等。
细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。
Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。
此区域高度保守，因此可检测多达19种支原体。
当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。
如果电泳图上出现259bp的清晰条带，对不起，你中招了。
以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原体的快速检测，引物与Sigma类似，也是扩增16S rRNA。
这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum的检测极限为5.5 CFU/ml，M. hyorhinis则为10.5 CFU/ml。
Stratagene新的MycoSensor QPCR Assay Kit通过实时定量PCR的方法来检测最低10个拷贝的支原体，连跑胶的时间都省了，整个过程只需要2小时。
阳性PCR产物的Tm值为85C，而内对照为82C，通过熔解曲线分析能将两者区分开。
另外，Stratagene也提供了PCR检测支原体的试剂盒。
如果你对杂交过程得心应手，还可以选择R&D公司的MycoProbe Mycoplasma Detection Kit。
它利用标记了碱性磷酸酶的寡核苷酸探针与16S 核糖体RNA杂交，随后用显色底物就能了解支原体的存在。
整个过程只需4.5小时，也还算快，能检测8种最常见的支原体。
用Hoechst 33258染料检测支原体是很多教科书推荐的方法。
由于支原体含有DNA，能与Hoechst 33258染料结合，在500倍放大情况下，表现为细小颗粒或纤毛染色。
但操作过程较繁琐，且需要一定的经验来辨别支原体，新手可能不大容易掌握。
特别值得一提的是：最近笔者尝试采用一种上海易色医疗科技有限公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》，其通过独特的滚环扩增技术，在一个温度下即可完成整个反应过程，而且整个检测过程一步即可完成，不需要电泳，肉眼直接判断反应结果，反应后反应管呈蓝绿色为阳性，粉红色则为阴性，非常方便快捷。
耗时也非常少，只需1小时。
据说其灵敏度比PCR灵敏10-1000倍，当然笔者没有具体去比较。
大家可以去尝试一下。
不过，预防支原体的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。
虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。