支原体污染-细胞培养技术
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
细胞支原体污染怎么办？该怎么处理？
甲：细胞里突然出现小黑点，问君能有几多愁?乙：珍贵的细胞萎靡不振，扔了重买?相顾无言，惟有泪千行。
丙：细胞转染效率极低，实验结果遥遥无期，我的课题前功尽弃!但见泪恨湿，不知心恨谁!细胞培养中，最怕的就是生物污染，支原体污染就是其中的一种。
支原体这种微小的微生物，是细胞培养中令人头疼的大问题。
支原体结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。
支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。
支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。
污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。
支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。
例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。
无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。
支原体污染在细胞培养中实际上是比较常见的，可达30%甚至更高。
支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。
定期检测支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。
一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。
将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
预防支原体污染的建议：细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理抗血清处理抗生素加抗血清和补体联合处理支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。
细胞培养中的支原体污染
生物特性：
无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，其直径仅有 0.13～0.18μm，是目前发现的最小细胞，并且变形能力大，故能通过滤菌 器。 革兰氏染色不易着色或呈阴性。 胞膜中含有胆固醇或其他甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物 理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很大。 多数支原体适合在偏碱性条件下生存（pH值7.6~8.0），对酸耐受性差。
原体是没有作用的。
支原体污染应对策略
新一代支原体抗生素M-Plasmocin 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合 成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。 可以强效对抗支原体及相关的无胞前对抗支原体最理想的 方法。
支原体污染来源
工作环境的污染
操作者本身的污染（包括操作者操作不当以及某些支原 体在人体是正常菌群） 实验器材的污染 培养基等试剂的污染
被污染细胞造成的交叉污染
制备细胞的原始组织或器官的污染
支原体污染的类型
口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans)
梨支原体(M. pirum)
莱氏无胆甾原体(idlawi）
支原体污染有时易被忽视！
1.培养液可不发生混浊
2.细胞病理变化轻微或不显著
3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从 培养器皿脱落
但支原体污染对细胞的影响却是极大的！！！
1、影响细胞的生长状态及形态 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至 停止；另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、 贴壁细胞脱落、裂解等。
支原体培养及药敏报告
支原体培养及药敏报告
支原体是一种革兰氏阴性细菌，是引起人类和动物呼吸道感染的主要病原体之一。
支原体感染可引起多种临床症状，包括咳嗽、咽痛、发热、头痛等，严重者可引起肺炎、支气管炎等疾病。
因此，对支原体的培养及药敏报告具有重要的临床意义。
支原体的培养是诊断支原体感染的重要手段之一。
通常采用细胞培养法或鸡胚培养法进行培养。
细胞培养法是将患者样本接种到细胞培养物中，通过观察细胞内外的支原体形态和数量来判断是否感染支原体。
鸡胚培养法则是将患者样本接种到鸡胚腔内，观察鸡胚的发育情况和病变表现，从而判断是否感染支原体。
培养的结果可以为临床医生提供重要的诊断依据，有助于制定合理的治疗方案。
除了培养外，药敏报告也是支原体感染诊断的重要内容之一。
药敏报告可以帮助临床医生选择最合适的抗生素治疗方案，提高治疗效果，减少药物滥用和耐药菌株的产生。
药敏报告通常包括对多种抗生素的敏感性测试结果，根据测试结果可以确定哪种抗生素对支原体的杀菌作用更好，从而指导临床治疗。
在进行支原体培养及药敏报告时，需要严格遵守操作规程，保证实验操作的准确性和可靠性。
同时，还需要注意对培养基、试剂和仪器的选择和使用，以确保培养和药敏测试的准确性和可靠性。
此外，对于培养和药敏测试结果的解读也需要具备专业的知识和经验，以避免误诊和漏诊的情况发生。
总之，支原体培养及药敏报告在支原体感染的诊断和治疗中具有重要的作用。
通过准确的培养和药敏测试，可以为临床医生提供重要的诊断和治疗依据，帮助患者尽快恢复健康。
因此，对支原体培养及药敏报告的研究和应用具有重要的临床意义，值得进一步深入研究和推广应用。
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
支原体肺炎的病原体分离和培养方法
支原体肺炎的病原体分离和培养方法支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae）是一种常见的致病原。
为了深入研究该病原体，科学家们开发了多种分离和培养方法。
本文将介绍一些常见的支原体肺炎病原体分离和培养方法，以供相关领域的科研人员参考。
一、支原体肺炎病原体分离方法1.直接培养法支原体肺炎病原体可以通过直接培养法从患者样本中分离出来。
一种常用的方法是通过鼻咽拭子或咳嗽痰液采集样本。
收集到的样本可以直接接种到预先准备好的培养基上，经过一段时间的培养，支原体肺炎病原体会逐渐生长并形成典型的菌落。
2.纤毛刷法纤毛刷法是一种常用的快速分离方法，适用于大规模筛查。
在该方法中，将纤毛刷插入患者的鼻腔收集样本，然后将纤毛刷放入含有蛋白消化酶的液体培养基中。
酶能够消化掉样本中的非细胞组织，并释放出被包裹在细胞内的支原体肺炎病原体。
然后，将液体培养基进行离心，离心过程中支原体肺炎病原体会沉积在离心管底部。
最后，从沉积物中取出支原体肺炎病原体进行后续培养和分析。
3.细胞培养法细胞培养法是一种通过培养细胞来分离支原体肺炎病原体的方法。
在该方法中，将患者样本接种到培养皿中的细胞培养基上，培养一段时间后，支原体肺炎病原体会侵入并感染细胞。
通过观察细胞的形态和特征，可以初步判断支原体肺炎病原体是否存在。
然后，可将感染的细胞进行收集和后续培养，以纯化和进一步研究病原体。
二、支原体肺炎病原体培养方法1.培养基的选择在进行支原体肺炎病原体的培养时，选择适宜的培养基十分重要。
通常，支原体肺炎病原体对一些特定的培养基非常敏感，如Hayflick培养基、PPLO（pleuropneumonia-like organisms）培养基等。
这些培养基中含有支原体肺炎病原体所需的营养物质和生长因子，能够提供良好的生长环境。
2.培养条件的控制支原体肺炎病原体的培养需要严格控制培养条件。
一般来说，适宜的温度是37°C，适宜的气氛是5%二氧化碳和95%空气的混合气体。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
M-Plasmocin
支原体感染的细胞
经M-Plasmocin处 理过的细胞
22
应对支原体污染的策略二
1.从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好 的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细 胞质量进行一系列检测。
2.预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度, 按照规范的实验程序操作。
3.定期对实验室中的培养物进行支原体检测。这也是国外 一些重要实验室的经验。一旦发现已经污染支原体的 培养物,灭活后弃之。更换新的培养物。避免支原体的进一 步播散。
23
24
支原体污染的类型
• • • • • • 口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans) 梨支原体(M. pirum) 莱氏无胆甾原体(idlawi）
5
支原体污染的来源
• 操作者无菌操作技术不当、 • 污染之培养基、血清、细胞等。 • 操作室环境不佳、实验器具不洁。
10
支原体污染对细胞的影响
• （4）支原体消耗细胞的核苷库—染色体异常
11
12
支原体污染对细胞的影响
• 3、其他
• 此外，支原体污染还会影响一些病毒在细 胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、 影响淋巴细胞分化等。
13
支原体污染的检测方法
• • • • • • • • 培养法 DNA荧光染色法 聚合酶链反应(PCR)法 电子显微镜法 相差显微镜检测 3-H胸腺嘧啶掺入法 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 低张处理地衣红染色观察
3333333
3
支原体的生物特性
◆是目前发现的最小细胞， 直径约为0.13-0.18μm。 ◆无细胞壁，不能维持固 定的形态，变形能力大。 ◆革兰氏染色不易着色或 呈阴性。 ◆胞膜中含有胆固醇或其 他甾醇。 ◆多数支原体适合在偏碱 性条件下生存（pH值 7．6~8．0），对酸耐受性 差。 ◆对热比较敏感，对一般 抗生素不敏感。 4
14
支原体污染的常用检测方法
• 1.培养法：原理是 利用营养丰富的培 养基,直接对待检细 胞、血清等进行支 原体培养。
缺点：灵敏度低，试 验周期长，不能检测 到种且不适用于检测 所有支原体。
15
支原体集落呈“油煎蛋”样
支原体污染的常用检测方法
• DNA荧光染色法 • 利用荧光Hoechst33258 标记细胞和支原体DNA, 在紫外光(波长为630 nm)激发下产生黄绿色 荧光,利用荧光显微镜 观察支原体是否存在。
6
科研人员的困惑
有些实验结果仅能 在支原体阳性的细 胞中得到
也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆 抗体实为针对所污染的支原体的抗 体。还有的科研成果,他人无法重复, 也因所用细胞有支原体污染所致。
实验结果真实性和可靠性大大 下降
7
支原体污染对细胞的影响
• 1、影响细胞的生长状态及形态
• 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物 质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至停止； 另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一 系列病变，表现为细胞收缩、贴壁细胞脱 落、裂解等。
8
支原体污染对细胞的影响
9
支原体污染对细胞的影响
2.影响细胞的代谢和功能 • （1）培液中的精氨酸被支原体大量消耗， 引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合 成障碍； • （2）支原体活动使培液成分发生改变（如 发酵型支原体降解糖类产生酸性物质）， 影响细胞代谢。 • （3）支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜 的完整性，影响细胞信号传递；
应对支原体污染的策略一
• 细胞一旦发生了支原体污染,应当弃之。虽 然已有了针对支原体的抗生素及最近出现 的所谓支原体清除剂,这些方法只能杀灭细 胞外的支原体。
• 除非是不可替代或无法重新获得的细胞一， 般没有必要进行支原体清除工作。
19
支原体的清除方法
20
支原体的清除方法
• 新一代支原体抗生素M-Plasmocin • 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核 糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一 种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA 的复制。 • 可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细 菌,同时又不影响细胞本身的代谢,且处理过 的细胞不会重新感染支原体,是目前对抗支 原体最理想的方法。
从门外汉角度谈—
支原体污染及防治
1
1
支原体污染易被忽视 1.培养液可不发生混浊 2.细胞病理变化轻微或不显著 3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚 至从培养器皿脱落
2
2
支原体高污染率
国内外研究表明，在细胞培养中，支原体感染 率达到30-60%
支原体污染已成为世界问题！
16
支原体污染的常用检测方法
• 缺点：有时易出 现假阴性和假阳 性
17
支原体污染的常用检测方法
• PCR法：通过扩增被 检测标本中的支原体 DNA ,再进行琼脂糖 凝胶电泳。电泳完毕, 将电泳胶在紫外投射 仪下观察,根据标准 分子量及阳性对照、 内对照条带,观察待 测样品中是否有阳性 条带。
18