成体人牙髓干细胞的分离与鉴定
牙源性干细胞的研究进展
3、牙源性干细胞的分型
3、牙源性干细胞的分型
牙源性干细胞的分型方法主要有免疫表型分析、细胞功能检测和基因表达谱 分析等。其中，免疫表型分析是通过检测细胞表面标志物的表达情况来确定干细 胞类型；细胞功能检测是通过观察细胞的分化能力和成瘤能力等来判断细胞的类 型；基因表达谱分析是通过检测细胞在不同发育阶段特异基因的表达情况来确定 细胞的类型。
研究现状
研究现状
牙源性干细胞具有自我更新和多向分化的能分为以下几类：
研究现状
1、牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）：来自牙髓组织的干细 胞，具有较高的增殖能力和多向分化潜能。
研究现状
四、年龄和性别
四、年龄和性别
年龄和性别也是影响牙周组织再生的因素。随着年龄的增长，PDLSCs的增殖 和分化能力逐渐降低，这可能导致老年患者牙周组织再生的效果不如年轻患者。 此外，男性和女性在激素水平上的差异也可能影响PDLSCs的功能和牙周组织的再 生。
五、其他因素
五、其他因素
还有一些其他因素可能影响牙周膜干细胞促进牙周组织再生的能力，包括患 者的全身健康状况、牙周病史以及生活习惯等。例如，患有糖尿病、骨质疏松症 等疾病的患者，或是有吸烟等不良生活习惯的患者，其牙周组织的再生能力可能 会受到影响。
研究成果
1、口腔组织工程
1、口腔组织工程
牙源性干细胞在口腔组织工程方面具有广泛的应用前景。通过与生物材料相 结合，可以构建出具有特定形态和功能的口腔组织，如牙齿、牙龈和唾液腺等。 例如，DPSCs与生物材料相结合可以促进牙齿组织的再生，有望为龋齿修复和牙 齿缺失的重建提供新的治疗方法。
2、牙齿发育与疾病模型
总结
总结
牙周膜干细胞促进牙周组织再生的能力受到多种因素的影响。这些因素包括 细胞因子、微环境、基因调控、年龄和性别以及其他因素。了解这些因素及其对 PDLSCs功能和牙周组织再生的影响，有助于我们设计更有效的牙周再生治疗方案。 在未来，我们期待对这些影响因素有更深入的理解，以便为牙周组织再生提供更 多的治疗策略和可能性。
干细胞培养中的细胞鉴定与鉴定方法
干细胞培养中的细胞鉴定与鉴定方法细胞鉴定是干细胞培养中至关重要的一步，它能够帮助科研人员确定细胞的纯度和特性，从而保证实验结果的准确性和可靠性。
在干细胞研究中，细胞鉴定的主要目的是检测细胞的多能性和细胞表面标记物的表达情况。
本文将介绍干细胞培养中常用的细胞鉴定方法，以及在干细胞培养中细胞鉴定的重要性。
一、细胞鉴定的重要性在干细胞培养中，细胞鉴定是确保所使用的细胞符合实验要求的关键步骤。
干细胞的特性和功能对于各种研究和应用领域具有重要意义，如再生医学、药物筛选、疾病模型的构建等。
因此，细胞鉴定的准确性对于确定细胞的纯度和特性是至关重要的。
细胞鉴定能够帮助研究人员确认所使用的细胞群体中是否存在其他非目标细胞类型的杂质。
通过检测细胞上的特定标记物，可以确定细胞的起源和特性，从而准确判断细胞的多能性。
此外，细胞鉴定还可以帮助研究人员监测细胞培养过程中的质量控制，及时发现并排除异常细胞。
细胞鉴定的结果直接影响着后续实验的设计和结果解释。
准确地进行细胞鉴定可以确保实验数据的可靠性和可重复性，而不准确的细胞鉴定可能会导致误导性的结论或不可靠的实验结果。
因此，在干细胞培养中，细胞鉴定是不可或缺的步骤，它有助于保证实验结果的准确性和可靠性。
二、常用的细胞鉴定方法在干细胞培养中，常用的细胞鉴定方法包括细胞表面标记物的检测和多能性的评估。
1.细胞表面标记物的检测通过检测细胞表面标记物的表达情况，可以确定细胞类型和特性。
常用的细胞鉴定方法包括流式细胞术（flow cytometry）、免疫细胞化学（immunocytochemistry）和细胞表面蛋白质鉴定（surface protein identification）。
流式细胞术常用于检测细胞表面蛋白质标记物的表达情况。
通过特定的抗体与细胞表面标记物结合，并使用荧光染料标记抗体来实现对标记物的定量检测。
该方法可以同时检测多个标记物，高通量检测，准确鉴定细胞群体中的不同细胞类型。
EMPs作用下DSP、DMP-1在人牙髓干细胞中的表达
人牙髓干细胞 DSP 少量细胞阳性表达，DMP-1 表达阴性，图 1。 经 200 μg / ml 的 EMPs 诱导 5 d 后，人牙髓干细胞 DSP、DMP-1 免疫组化染色呈阳性表达，图 2。
图 1 人牙髓干细胞 DSP、DMP-1 表达（ ×P、DMP-1 在人牙髓干细胞中的表达 第 6 期
·1221·
机冻干备 用。蛋 白 电 泳 （ SDS-PAGE） 表 明，条 带 主 要 分 布 在 20、13、5 kD。与束蓉等〔6〕的报道一致。使用时按照所需浓度 加入培养液稀释。 1. 2. 2 人 牙 髓 干 细 胞 的 分 离，原 代 培 养 参 考 并 改 进 Gronthos 等〔7〕的方法，将自愿者因正畸需要拔除的前磨牙浸泡 于碘伏中消毒 10 min，置于预冷的 D-Hanks 液中带回实验室。 无菌条件下在釉牙骨质界处劈开牙齿，取出牙髓，剪弃根尖部 牙髓组织约 1 mm，0. 01 mol / L PBS 反复冲洗，剪成 1 mm3 小 块，移入含 3 g / LⅠ型胶原酶和 4 g / L dispase 酶（ 1∶ 1） 的离心管 里，37℃ 消化 2 ～ 3 h，至无成形的牙髓组织为止。高压灭菌后 的 70 μm 筛子过滤成单个离散的细胞悬液，1 000 r / min 离心 3 min，弃上清以洗净胶原酶，接种于 25 ml 塑料培养瓶，置于 5% CO2 ，饱 和 湿 度，37℃ 恒 温 孵 育 箱 中 培 养。 培 养 液 为 DMEM / F12，15% FBS。细胞贴壁后 2 ～ 3 d 换液 1 次，弃去未贴 壁细胞，在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 的 形 态，待 细 胞 生 长 达 80% ～ 90% 汇合时常规传代。 1. 2. 3 EMPs 诱导后 DSP、DMP-1 在人牙髓干细胞中的表达 取第一代人牙髓干细胞以 1 × 104 / ml 的密度接种于预置有无 菌盖玻片的 24 孔板中，每孔 1 ml，实验组加入浓度为200 μg / ml 的 EMPs。以 不 加 EMPs 孔 为 对 照 组，加 入 DMEM / F12，15% FBS 培养液，5% CO2 ，饱和湿度，37℃ 恒温孵育箱中培养。分 别于 3、5、7、9、11 d 对细胞进行免疫组化染色。检测细胞爬片 DSP、DMP-1 的表达。
干细胞细胞形态鉴定-显微镜法
干细胞细胞形态鉴定-显微镜法干细胞是一类具有自我更新和多能分化潜能的细胞，具有重塑组织和器官的潜在能力。
干细胞的研究和应用在医学领域有着巨大的潜力，可以为临床治疗各种疾病提供新的治疗方法。
而要对干细胞进行研究和应用，首先需要对干细胞进行形态鉴定，以确保所使用的细胞具有干细胞的特征。
本文将主要介绍干细胞细胞形态鉴定中的显微镜法。
一、干细胞的概述干细胞是一种具有自我更新和多能分化能力的细胞，可以不断地分裂产生自身的同源细胞，同时也可以分化为多种不同类型的细胞。
根据其来源和分化潜能的不同，干细胞可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两种类型。
胚胎干细胞来源于早期胚胎，具有最广泛的分化潜能，可以分化为几乎所有类型的细胞。
成体干细胞则存在于成体组织中，具有一定的分化潜能，可以分化为特定类型的细胞。
由于其多能性和自我更新能力，干细胞在组织工程和再生医学中具有广泛的应用前景。
二、干细胞的形态特征在进行干细胞形态鉴定时，需要注意观察其形态特征。
胚胎干细胞通常为圆形或椭圆形，胞质较多，胞核较大，胞浆与核浆比例较小。
胚胎干细胞具有较强的增殖和分化潜能，通常呈现为较为松散和不规则的形态。
成体干细胞的形态特征则因来源不同而异。
骨髓间充质干细胞通常为纤维状或星状，细胞体积较大，胞核圆形或椭圆形，胞浆较多。
而神经干细胞则具有较小的细胞体积和较长的突起，胞核圆形或卵圆形。
在进行形态鉴定时，需要结合干细胞来源和性质来进行综合分析。
三、干细胞的显微镜观察干细胞的形态鉴定通常需要借助显微镜进行观察。
在进行显微镜观察时，需要选择适当的显微镜和镜头，调整合适的放大倍数，以便观察干细胞的形态特征和细胞结构。
在显微镜下观察干细胞时，需要先将干细胞标本放置在显微镜玻片上，再借助激光或透射光源对干细胞进行照射，观察其在显微镜下的形态特征。
需要特别注意观察干细胞的细胞核、胞浆、细胞膜等部分的形态特征，并结合细胞染色技术进行细胞器的染色观察。
四、干细胞的形态鉴定标准干细胞的形态鉴定标准主要包括细胞形态、细胞器结构、细胞膜完整性等方面。
干细胞鉴定方法总结
干细胞鉴定方法总结干细胞是具有自我更新能力和分化为不同细胞类型的特性的细胞。
由于其潜在的临床应用前景，干细胞研究成为了当前生物医学领域的热点之一。
然而，干细胞的鉴定一直是研究者亟待解决的问题之一。
本文将对目前常用的干细胞鉴定方法进行总结，并评估其的优缺点。
首先，流式细胞术是一种常用的鉴定干细胞的方法。
该方法利用细胞表面标记分子的差异来区分不同类型的细胞。
通过选择性地标记干细胞表面的特定蛋白质，可以识别和鉴定干细胞。
流式细胞术具有高效、快速的优点，能同时检测多个标记物。
然而，该方法需要特定的仪器设备，并且对于一些干细胞表面标记物的选择可能存在争议。
其次，免疫组化和免疫荧光染色是常用的干细胞鉴定方法之一。
这些方法通过检测特定蛋白质的表达来确定细胞类型。
通过使用特异性抗体标记干细胞表面标记物，可以鉴定干细胞。
免疫染色方法简单、直观，可同时检测多个标记物，同时还可以通过染色程度的强弱来评估其表达水平。
但是，免疫染色方法对于标记物的选择也存在一定的局限性，其信号显著性和特异性取决于抗体的选择和特异性。
此外，多能性基因表达分析也是一种常用的干细胞鉴定方法。
通过检测干细胞特有的基因表达模式，可以确定其干细胞的特性。
例如，Oct-4是一种常用的标记干细胞的基因，其表达水平可以用于确定细胞的多能性。
此外，还可以通过测量其他多能性相关的基因和转录因子的表达水平来鉴定干细胞。
这种方法可以提供定量的结果，并且具有较高的特异性。
然而，这种方法需要高度专业的基因分析设备和操作技术，并且不适用于检测所有类型的干细胞。
最后，体外分化能力是一种常见的干细胞鉴定方法。
通过将干细胞分化为不同细胞类型，在细胞功能和形态上的改变来鉴定干细胞。
例如，对于胚胎干细胞而言，其具有多向分化的能力，可以分化为三胚层中的不同类型细胞。
干细胞的分化能力是干细胞的重要特性之一，可以通过体外培养和诱导分化来确定。
这种方法可以提供实际的细胞功能信息，并且具有较高的准确性。
七年级上册动植物的结构层次(第二章第3节)(原卷版)
浙教版九年级上册第二章第3节动植物的结构层次【考点串讲】动物的结构层次植物的结构层次一.细胞的分裂、生长和分化1.细胞分裂：（一个细胞变成多个细胞）意义：使细胞数目增多2.细胞生长（细胞变大的过程）意义：使细胞的体积增大3.细胞分化（一种变多种）意义：细胞分化形成组织二.组织1.概念：细胞分化形成的各种不同形态和不同功能的细胞群2.植物的基本组织：保护组织、输导组织、机械组织、营养组织、分生组织。
3.人体的四大组织：肌肉组织、神经组织、结缔组织、上皮组织。
三.器官和系统1.器官：由多种组织构成的、具有一定功能的结构称为器官被子植物的器官：根、茎和叶与植物制造自身营养物质和生长有关，称为营养器官；花、果实和种子与植物的生殖有关，称为生殖器官人和动物的器官：眼、耳、鼻是感觉器官；胃、肠、肝和胰是消化器官；肺或鳃是呼吸器官；心脏和血管是循环器官；睾丸和卵巢是生殖器官；肾和膀胱是排泄器官2.系统（动物特有）概念：能够共同完成一种或几种生理功能的过个器官，按照一定的顺序排列在一起构成系统人体八大系统：消化系统、循环系统、呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、神经系统、运动系统和内分泌系统四.结构与层次1.单细胞层次的生物：有些生物是由一个细胞组成的，如草履虫2.组织层次的多细胞生物：某些低等生物，虽然有许多细胞组成，而且分化出简单的组织，但结构相当简单。
3.动植物体结构层次总结如下植物体的结构层次：细胞→组织→器官→植物体动物体的结构层次：细胞→组织→器官→系统→动物体4.动植物体结构层次之间的联系：结构相似功能相同的细胞共同组成了组织，多种组织一起组成了器官有了特定的功能，不同的器官一起共同作用组成了系统（动物特有），不同的系统组合而成多细胞生物个体。
【专题过关】一、选择题1．（2022·绍兴期末）下列关于一株水蜜桃和一个人的叙述中错误的是（）A．他们的遗传物质都在细胞核内B．水蜜桃的花、人的心脏都属于器官C．它们都是受精卵不断分裂、生长和分化的结果D．它们的结构层次都是细胞→ 组织→ 器官→ 系统→个体2．（2021·绍兴期中）从一个受精卵发育成一个可爱的宝宝，让我们看到了生命的神奇过程，下列叙述错误的是（）A．①①①表示细胞分裂，①表示细胞分化B．细胞分裂的意义是细胞数目增多C．人体内的血液属于图中的结缔组织D．细胞分化可导致细胞中遗传物质改变3．（2021·温州期中）上了细胞的变化课后，小科同学对从受精卵开始的一系列细胞变化的过程进行了总结概括如图，有关分析不正确的是（）A．a过程中发生了遗传物质的复制和平分B．生物的所有细胞都能进行a过程C．b中细胞的基本结构相同D．b中细胞含有相同的遗传物质4．（2021·温州期中）新移栽的树上面经常会看到挂着蓝色的小袋子（如图），里面还有药液在给树木输液。
牙髓干细胞成牙及成骨向分化调控方法的研究进展
牙髓干细胞成牙及成骨向分化调控方法的研究进展孟士翔; 郭晓霞【期刊名称】《《基础医学与临床》》【年(卷),期】2019(039)010【总页数】4页(P1499-1502)【关键词】牙髓干细胞; 牙本质; 再生; 分化; 调控【作者】孟士翔; 郭晓霞【作者单位】首都医科大学北京口腔医院北京 100050; 首都医科大学基础医学实验教学中心北京 100069【正文语种】中文【中图分类】R318牙髓干细胞(dental pulp stem cell, DPSC)是一种在牙髓中具有多向分化能力与自我更新能力的细胞，与骨髓间充质干细胞有着相似的免疫表型和分化能力。
DPSC 可以被诱导分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、血管内皮和肝等多种细胞类型。
其可从被摘除的牙中轻易分离，不存在伦理争议，且免疫原性较低，因此与其他种类间充质干细胞相比应用前景更为广泛，被视为再生医学中一种理想的种子细胞。
本文将介绍化合物诱导分化、物理方法诱导分化和支架及表面形貌诱导分化等调控方法与途径，并分析提出不同调控途径的优势与不足。
1 通过化合物诱导分化在牙齿发生的过程中，细胞外基质内存在复杂的信号分子与通路参与对DPSC增殖与分化的调控。
故可使用各种化合物处理DPSC，从而上调有关信号分子的表达或直接激活相关通路，调控DPSC的分化。
一氧化氮是一种作用广泛的信号分子，在多种信号的传导通路中起到重要作用，在体外其对干细胞也有一定诱导分化的作用。
用可持续释放一氧化氮的化合物NOC-18处理大鼠DPSC后，一氧化氮通过激活TNF-NF-κB轴促进大鼠DPSC分化，使细胞出现长胞质突起与核的极化，成牙本质向分化特异基因的表达水平和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性提高，组织矿化，使DPSC成牙本质细胞向分化。
于大鼠受损牙的牙髓腔中使用NOC-18有效地促进了第三期牙本质的生成[1]。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是一组多功能的分泌性蛋白，在细胞分化、基质分泌与矿化等多个过程中起到重要的调控作用，可刺激间充质干细胞向成牙细胞与成骨细胞转化。
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定间充质干细胞或间充质基质细胞（MSC）是可以从各种来源（包括骨髓，脂肪组织或脐带）分离的体细胞或成体干细胞。
分离的MSC 是表现出位点特异性分化的成纤维细胞样细胞。
MSC可能在体内再生受损或患病的组织，并可能在免疫调节中发挥作用，这为各种临床应用提供了基础。
1:缓冲液准备1.1 PE（PBS+EDTA）缓冲液，用于分离单核细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2和2mM EDTA制备溶液。
低温（2–8°C）保存。
▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
1.2 PBE(PBS+BSA+EDTA)缓冲液，用于分离CD271 +细胞。
准备包含磷酸盐缓冲盐水（PBS）的溶液，用autoMACS®冲洗溶液以1:20的比例稀释MACS®BSA储备溶液，可得到pH 7.2、0.5％的牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA。
低温（2-8°C）存放。
▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
BSA可以用其他蛋白质代替，例如相应的血清白蛋白，相应的血清或胎牛血清（FBS）。
不建议使用含有Ca2 +或Mg2 +的缓冲液或培养基。
2：分选单核细胞2.1梯度密度离心2.2人骨髓单个核细胞(BM MNCs)的制备▲注意：仅使用新鲜骨髓。
避免冷冻和解冻骨髓细胞，并在无菌条件下进行。
1.用针头从髂骨上嵴或胸骨采集骨髓。
2.用缓冲液以7：1的比例稀释抽吸的人骨髓，例：用5mL缓冲液稀释30mL的骨髓，最终体积为35mL。
3. 100µm过滤器过滤，去除骨碎片和细胞团。
（▲注：使用前，先用缓冲液的润洗滤器。
）4.将35ml稀释的细胞悬浮液与15ml的Ficoll-Paque混合于50ml 圆锥形瓶中。
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成体人牙髓干细胞的分离与鉴定杨雪超樊明文武汉大学口腔医学院(430079)email:yangxuecao@摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。
方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。
扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。
结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。
Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。
成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。
结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。
关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞1．引言目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。
干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。
干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。
研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。
最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法2.1 材料α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage）2.2 方法2.2.1细胞培养和克隆采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。
将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。
培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。
细胞计数板计数- 1 -细胞浓度，调整后以1－2个细胞／孔的浓度接种于96孔板，常规培养7-14天，至出现细胞克隆（细胞数≥50为判定标准），扩大培养。
2.2.2 Hoechst33342染色成功扩大培养的细胞克隆，取其第四代接种于6孔板，常规培养24小时，更换培养液（无血清的α-MEM，含0.12μg/ml Hoechst33342），37℃暗处孵育30分钟后1.5％冷福尔马林固定15分钟，冷PBS充分漂洗。
倒置荧光显微镜下340nm波长光激发后观察荧光表达情况，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。
2.2.3 细胞的定向诱导分化成功扩大培养的细胞克隆，待生长至90%汇集，0.15%胰酶消化后，以5x103/cm2接种于6孔板和24孔板。
传代后第二天改为诱导液培养（矿化液为含10%胎牛血清，50μg/ml α-抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠的α-MEM；脂肪分化体系为含10%胎牛血清，10－6M 地塞米松，0.5mM IBMX，0.1mMα-抗坏血酸的α-MEM）。
2.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性细胞接种于24孔板，矿化液连续培养14天，弃去矿化液，0.01M冷PBS冲洗三遍，每孔加入细胞裂解液200μL，室温振荡10分钟，收集上清液。
按照试剂盒说明检测细胞的ALP活性。
2.2.5 矿化结节细胞接种于6孔板，矿化液连续培养14天，中止培养，0.01M冷PBS冲洗三遍，4%中性福尔马林固定后进行Von Kossa染色，具体方法参见文献[8]。
2.2.6 牙本质唾蛋白（DSP）的检测细胞接种于6孔板，每个克隆有5个复孔，一部分细胞加矿化液连续培养；对应复孔细胞则用常规培养液培养。
14天行DSP免疫荧光染色。
具体操作步骤为：冷PBS洗去细胞表面培养液，以4%中性福尔马林固定15分钟后，-20℃甲醇继续处理10分钟；正常山羊血清封闭20分钟，兔人DSP特异性抗体4℃孵育过夜，PBS洗3次；FITC标记二抗37℃作用30分钟，PBS洗3次；水性封片剂封片，荧光显微镜下观察。
取矿化诱导前后细胞蛋白样品20μg经5－12％ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。
用1％BSA室温孵育1h，以封闭非特异性结合位点，加入兔人DSP特异性抗体4℃过夜。
根据相应的二抗及三抗，DAB显色5～10分钟，观察Western blot结果。
2.2.7 Oil Red-O 染色经脂肪分化体系诱导培养21天后，部分细胞4％中性福尔马林固定10分钟，Oil Red-O 染液常温孵育1小时，充分漂洗后镜检，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。
2.2.8 PPARr2基因的表达提取培养细胞总RNA，参考Genebank检索数据设计PPARr2特异性引物，上游：5' CTCCTATTGACCCAGAAAGC 3'，下游：5' GTAGAGCTGAGTCTTCTCAG 3'。
RT-PCR检测PPARr2基因的表达。
反应条件：50℃ 30min逆转录，94℃2min逆转录失活，然后94℃45s，56℃ 45s，72℃ 60s，35个循环，72℃延伸7min。
PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化后测序。
以正常人脂肪细胞细胞作为阳性对照。
3. 结果3.1 细胞生长和形态通过消化和滤网过滤，细胞皆以单细胞方式贴壁生长，24小时内呈类圆形或不规则形，伸展不完全；24小时后少数单个细胞开始分裂增殖[图一]，7天后少数细胞增殖能力旺盛形成克隆[图二]，细胞克隆呈三角形，多角形等多种形态，但都有一共同特点——从中心向四周放散生长。
消化分散后，多数细胞能够形成克隆[图三]。
3.2 Hoechst33342染色体外培养的第四代克隆来源细胞经Hoechst33342染色后，大部分细胞荧光表达阴性或弱- 2 -阳性[图四]；而对照组绝大多数细胞为阳性表达。
3.3 ALP活性与矿化结节克隆来源细胞用矿化液连续培养14天，肉眼观可见白色点状物，倒置显微镜下细胞呈复层生长，局部形成白色的矿化结节，Von Kossa染色显示其中央区为紅黑色，周围逐渐变浅[图五]。
对照组细胞虽然也可以形成细胞结节，但Von Kossa染色阴性，证实无矿化形成。
细胞经14天矿化液诱导培养后，其ALP活性与矿化结节的形成能力存在正相关。
t检验结果表明[表一]克隆来源细胞细胞的ALP活性皆明显高于对照组细胞（P<0.05）。
表1 细胞ALP活性比较（X±S）细胞n ALP活性（U/gpro）克隆来源对照组 242442.37±1.9822.34±2.09 **P<0.053.4 DSP的表达荧光显微镜下观察，克隆来源细胞经矿化液诱导培养14天后，DSP染色强阳性，细胞呈明亮绿色[图六]；未用矿化液诱导的复孔细胞及对照组细胞染色很弱，呈现模糊的暗暗绿色背景。
Western blot检测显示，矿化诱导后克隆来源细胞可见95KD处有DSP条带出现，诱导前则无[图七]。
结果表明，克隆来源细胞经矿化液诱导培养后，有体外合成分泌DSP的能力，而DSP是目前衡量向成牙本质细胞分化成熟的一个最重要指标，从而证明细胞具有向成牙本质细胞分化的能力。
3.5 成脂肪分化检测克隆来源细胞经成脂肪分化体系诱导培养21天后，光镜下可见细胞胞体明显肥大，折光度增加，富含脂滴并形成特殊的“鸡尾样”结构[图八]，Oil Red-O 染色阳性[图九]，而对照组细胞为阴性。
RT-PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果在340bp处有一特异性扩增条带（图十），与阳性对照条带相同，经测序后发现产物为PPARr2基因序列，说明诱导后有PPARr2基因的表达。
4.讨论成体干细胞是近年来干细胞研究领域的新热点，一方面这是对传统发育生物学观点的革新[9]；另一方面由于利用胚胎干细胞面临复杂的伦理学问题和实际操作中的困难，因而对成体干细胞的研究及应用就更具有深远的意义。
目前已经证明，在机体许多成熟组织器官中存在成体干细胞，关于牙髓干细胞的研究是在口腔医学领域刚刚开始的一个热点。
Gronthos等人[6，10]最早对人牙髓干细胞进行了研究，从成体牙髓组织中分离出的克隆形成细胞具有向成牙本质细胞分化的能力，首次证明了成体牙髓干细胞的存在。
本研究在此基础上对此克隆形成细胞体外诱导分化，通过ALP活性，矿化结节形成和DSP的表达三个方面检测向成牙本质细胞方向分化的能力；通过Oil Red-O 染色和PPARr2基因表达检测向脂肪细胞横向分化的能力。
成牙本质细胞的主要功能是形成牙本质，ALP是参与骨等矿化组织代谢和再生的一种功能性标志酶，也参与牙本质的形成。
研究表明，牙乳头外胚间充质细胞向成牙本质细胞分化的过程中分泌矿化前基质，在ALP等矿化因子作用下最终形成牙本质[11]，成牙本质细胞具有较高水平的ALP活性。
本研究中，在矿化液诱导条件下，克隆来源细胞ALP活性水平显著高于对照组细胞，同时能够复层生长形成矿化结节，这初步证实这五组克隆具有形成牙本- 3 -质的能力。
牙本质唾磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因编码表达牙本质唾蛋白(DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein,DPP),皆是唯一由成牙本质细胞合成和分泌的，只在牙本质中存在的蛋白，属于牙本质特异性基质非胶原蛋白，目前认为其是成牙本质细胞的特异性标志物[12]。
过去由于缺乏特异性抗体来检测DSP的表达，多采用RT-PCR方法在mRNA 水平进行检测，但蛋白质水平检测始终是衡量分化成熟的金标准。
本研究中使用NIDCR提供的兔抗人DSP抗体，采用免疫荧光法在蛋白水平检测DSP的表达，克隆来源细胞诱导后呈阳性着色，能够表达DSP；诱导前则着色阴性，不能够表达DSP，这一转变正是一个分化的过程。