实验六 食品中志贺氏菌的检验
实验六食品中志贺氏菌的检验
一、实验目的要求
1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。
2、掌握志贺氏菌的生物学特性。
3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。
5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。
二、原理
志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。
三、试剂和仪器
（一）最先准备的器材
规格名称数量用途
1、500ml广口瓶1个稀释样品
2、500ml三角瓶1个制增菌液
3、250ml三角瓶6个制培养基
4、18×180mm试管8支制三糖铁培养基
5、13×100mm试管40支制蛋白胨水等
6、1ml移液管2支
7、10ml移液管 2 支
8、直径为90 mm平皿12套制SS、EMB平板
9、250ml量筒1支
（二）应灭菌的其它器材
剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量
（三）应准备的培养基和试剂
培养基总量所用容器
1.GN 增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶
2.EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
3.SS琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
4.三糖铁斜面6ml/支6支15×150mm试管
5.葡萄糖半固体培养费基4ml/支5支13×100mm试管
6.蛋白胨水2ml/支5支13×100mm试管
7.5%乳糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管
8.甘露醇发酵管3ml/支5支13×100mm试管
9.棉子糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管
10.甘油发酵管3ml/支5支13×100mm试管
11.兔血浆3ml/支1支13×100mm试管
12.多价血清和26种因子血清
四、实验内容
样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴别→→结果报告
第一天样品处理和增菌培养
（一）、样品处理
无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均
质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研
磨使其乳化。
（二）、增菌培养
放于36℃培养6～8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
第二天接种选择性平板进行分离培养
（一）、接种选择性平板
取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦
康凯琼脂平板和EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。
（二）、培养
放于36℃培养18～24h。
结果：志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落
第三天初步生化试验
（一）、接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基
从SS、EMB琼脂平板、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。经36℃培养18～24h，分别观察结果。
（二）、培养
放于36℃培养18～24h。
结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力
可以弃去的培养物：
a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b.在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d.产气的培养物；
e.有动力的培养物；
f.产生硫化氢的培养物。
第四天、血清学分型和进一步的生化试验
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
（一）、血清学分型鉴定
从三糖铁琼脂上挑取培养物，做玻片凝集试验。
第1步、先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；
第2步、如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。
第3步、如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
第4步、4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原
（二）、进一步的生化试验
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、甘油的发酵、靛基质试验。
1、接种生化培养基
从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到：
5%乳糖、甘露醇、棉子糖、甘油、靛基质培养基中
2、观察试验结果
志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A 群或C群相似，见表2。
表2 志贺氏菌属四个群的生化特性
（三）、结果报告：
综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告
五、思考题
1、如何提高志贺氏菌的检出率？
2、志贺氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？解释这些现象？
3、志贺氏菌检验有哪5个基本步骤？
4、食品中能否允许有个别志贺氏菌存在？为什么？