免疫组化染色操作顺序
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
病理科业务学习免疫组化染色步骤
•切片取出后放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
• 取出放入3%过氧化氢水溶液中5-10分钟，以去除内源性 过氧化物酶。
• 取出放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
•取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，注意保持组织湿润状 态但表面不能有液体，要求抗体全部覆盖组织面，不能有气泡，以 使抗体能全部与组织接触。
•取出切片，擦干组织周围体后滴加DAB，显色时间5分钟左右， 如显色时间太短，阳性强度不够，阳性部位不突出，如显色时间过 长，背景着色较深，阳性部位对比差，均不利于诊断。
• 取出洗去DAB，放入苏木素中复染细胞核，一般时间为40 秒左右（依照苏木素新旧不同可适当增减时间）
• 分化、反蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
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免疫组化染色步骤
免疫组化标准操作程序
1、常规石蜡切片厚度3～4微米，放入80℃烤片机烤片15分 钟； 2、切片脱蜡程序： 二甲苯I、II、III脱蜡各10分钟； 无水乙醇I、II各5分钟； 95%乙醇I、II各5分钟。 3、流水冲洗，待组织修复。
•组织修复采用高温高压法：待高压锅内EDTA修复液沸腾后，放入 切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，一般修复时间 为2.5-3分钟。
•滴加一抗后放入专用孵育盒内室温孵育1-2小时或4℃冰箱内过夜。 由于一抗孵育时间较长，因此一抗滴加量不宜过少。
•甩掉一抗，切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤， 防止因洗涤不净引起的非特异性染色。
•滴加辣根酶标记聚合物（基本要求同一抗），室温孵育时间为2025分钟。
•取出切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤，防止因洗 涤不净引起的非特异性染色。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法2.1 实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
2.2 仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
2.3 主要试剂的配置（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠 2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）A液：0.1M柠檬酸溶液(4℃保存)29.01g柠檬酸1000mlddH2OB液：0.1M柠檬酸钠溶液(4℃保存)29.41g柠檬酸钠1000mlddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)900mldH2O充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0（3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)0.1%Triton的配制Triton原液0.1 ml0.01PBS液99.9ml4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清50µl0.1%Triton 950µl4℃保存。
2.4 免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。
免 疫 组 化 染 色 步 骤
免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡和水化。
二甲苯I（10min），二甲苯II（10min），二甲苯&酒精1:1（10min），100%酒精（5min），95%酒精（5min），75%酒精（5min），50%酒精（5min），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2.抗原修复（微波炉P-100 4-5min煮沸，P-40 维持15min，每隔4-5 min加一次柠檬酸缓冲液，不能烧干片）。
静置缓慢冷却至室温，组化笔画圈将组织圈起来（离组织边缘1-2mm），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
3.封闭内源性过氧化物酶。
每张切片加适量的3%H2O2（将组织块儿覆盖即可），室温孵育15min（湿盒内，防干片），阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
4.封闭。
每张切片加适量的5% 血清或者脱脂牛奶（PBS配，组织块儿覆盖即可），孵育15分钟（湿盒内），以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
5.除去封闭液，每张切片加适量一抗，室温下孵育60分钟或4℃过夜。
6.PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl放大剂(试剂A)，室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl多聚酶结合物（试剂B），室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
8.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB 或AEC使用说明书），显微镜下观察5-15分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
9.自来水冲洗，苏木素复染（20-30s），自来水冲洗，PBS返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂（详见迈新产品AEC-0038）封片。
可能出现的问题及解决办法:1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
免疫组化染色步骤(精)
免疫组化染色步骤
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3x3`。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃
过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵
育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。
PBS冲洗3x3`。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用
说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
8. 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果
用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。
封片。
免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学技术：染色步骤免疫组织化学技术:染色步骤一、免疫荧光法１．直接法（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次（4）50%甘油缓冲液封片（5）荧光显微镜下检查（6）对照染色①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。
②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。
③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。
④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。
或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。
对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。
2．间接法（1）标本处理同直接法。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。
（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。
（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
３．补体法（１）标本处理同直接法。
（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。
ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。
（４）甘油缓冲液封片。
（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。
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精心整理免疫组织化学染色原理和操作步骤
一、免疫组织化学原理
免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。
二、实验准备：
1.标本准备
图2.SP法原理示意
①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理
②冰冻组织切片：由病理室常规处理
③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2h。
2.试剂准备
①抗体选择
单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。
因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，
，货号85-9043
③DAB
3.
4.
5.
10
Na242
KH2PO4 4.3g
加蒸馏水至1000ml，充分混匀贮存。
使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。
②柠檬酸抗原修复液
抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：
称取柠檬酸10.5g，溶于500ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O57.3g，溶于800ml蒸馏水。
分别量取358ml柠檬酸溶液和642mlNa2HPO4溶液，充分混匀后调整pH值至6.0，即得2×母液，贮
存备用。
③1%盐酸酒精
浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。
三、免疫组化操作步骤
1.组织片脱蜡水化
①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15min。
②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5min。
2.
3.
4.
液，根
37℃放置20min。
⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
5.显色
①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50µl（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28℃放置5~20min，甩干。
②置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
③滴加新鲜配制的DAB工作液100µl（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时
（3~5min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；
6.复染
浸入苏木精溶液中复染，放置5min后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用1%盐酸酒精分化1—2s后，自来水冲洗后，反蓝水洗2min。
7.脱水、透明和封片
①依次放入95％、95％乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；
②依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。
8.
1.
DAB
性。
2.
）。