β-内酰胺酶及其活力测定法
牛乳制品青霉素酶的检测方法探析
牛乳制品青霉素酶的检测方法探析一、β-内酰胺酶检测方法及原理现有的青霉素酶的检测方法有碘量法、酸度法、高效液相色谱法、酶联免疫法、头孢硝噻吩显色法以及杯碟法等。
碘量法是《中国药典》中规定的检测β-内酰胺酶活性的方法，该法方便快捷、检出限高。
现阶段，牛乳制品中β-内酰胺酶的检测方法采用的是卫生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法》，该方法可以检测出生鲜乳中未反应完全的β-内酰胺酶，可用于检测未经过任何加工的牛奶，并且检出限较低，容易区分外源性和内源性β-内酰胺酶。
其检测原理是以一种对青霉素高度敏感的细菌作为指示菌，实验时如果被测牛奶样品含有青霉素酶，破坏了青霉素，指示菌株即可生长，否则指示菌将被抑制。
同时，通过与标准品比对抑菌圈的大小，可以定量地确定β-内酰胺酶的含量。
崔生輝等运用β-内酰胺酶特异性抑制剂舒巴坦建立了该酶的检测方法，该方法在牛奶中的检出限为4U/mL。
目前，微生物法仍然是实验室检测牛奶中β-内酰胺酶的主要方法。
二、材料和方法（一）材料和试剂青霉素酶（P0389，sigma）；Zeba Spin 脱盐柱（89889，Thermo Scientific）；青霉素酶抗体（ab12251，Abcam）；青霉素酶（ab10712，Thermo Scientific）；Chroma Link™ Biotin （B-1001-010，Solulink）；鸡抗鼠IgG （ab6706，Abcam）；Alpha Screen®Streptavidin Donor beads（6760002，perkinelmer）；Alpha Screen® Unconjugated Acceptor Beads（6762001，perkinelmer）。
（二）方法2.1抗原的纯化及生物素化抗原的纯化：将青霉素酶溶解于修饰缓冲液（100mmol/L 磷酸钠，150mmol/L NaCl，pH8.0）中，用Zeba Spin脱盐柱进行液体交换和脱盐净化。
β--内酰胺酶
β--内酰胺酶β-内酰胺酶及其检测方法β-内酰胺酶是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶。
β-内酰胺酶（β-lactamase）的产生是细菌对(β内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，，广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌，在各种耐药机制中占80%。
β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β-内酰胺环，导致β-内酰胺类抗生素失活，这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。
它的种类和数量现已超过了400种，β-内酰胺酶分类比较多而复杂，最常用的有两种，即分子生物学方法和布氏法。
其检测方法包括常规方法和分子生物学方法。
前者包括微生物法，碘量法，纸片酸度定量法，.产色头胞菌素法；后者包括转移性分析，基因分析，酶蛋白性质分析。
一β内酰胺酶的合成、定位及传播方式β内酰胺酶既可以在细菌内组成型表达，如铜绿假单胞菌；又可以由质粒介导的诱导表达，如嗜水气单胞菌及金黄色葡萄球菌。
而质粒介导的方式是细菌耐药性传播的一个主要机制，在革兰氏阴性菌中利用接合的方式进行传播，而在革兰氏阳性菌中利用转导的方式获得耐药性状。
细菌的这种耐药性状的可转移性正是细菌耐药性爆发的原因。
在革兰氏阴性菌中，β内酰胺酶象胞外酶一样被分泌到膜外的环境，而在革兰氏阳性菌中，β内酰胺酶在它与受体结合以攻击抗生素的之前则停留在周质腔中。
二β内酰胺酶的作用机制β内酰胺酶破坏β内酰胺抗生素的β内酰胺环有两种作用机制。
第一，绝大多数常见的β内酰胺酶有一个依赖丝氨酸发挥作用的机制，并且根据氨基酸序列组成分为三类（A，C和D）。
通常它们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔（氧阴离子袋），这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。
由于β内酰胺环上的羰基碳在结合β内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物，进而重建了β内酰胺酶。
这类酶对青霉素、头孢菌素、单内酰环类抗生素都有活性。
细菌β-内酰胺酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
10．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/20 微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量 （本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 12．β-内酰胺酶活性单位浓度定义：在 37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解 1 微摩尔的头
[（样品读数－背景读数）X 样品稀释倍数 X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 20.5 （毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫 克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔头孢硝噻吩/分钟
注意事项
1． 本产品为 20 次（比色皿）和 80 次（酶标板）操作 2． 操作时，须戴手套 3． 底物液（Reagent D）避免光照和反复冻融 4． 用户可以根据需求，配制反应工作液，不宜存放 5． 如果样品有限酶活性过低，建议使用细菌β-内酰胺酶活性荧光定量检测试剂盒（GMS10093.3） 6． 反应孵育完成后，即刻进行比色测定 7． 测定值由低到高变化；测定持续 10 分钟 8． 比色测定后，比色皿须清洗彻底 9． 样本测定 10 分钟读数高于 0 分钟读数表明具有酶活性
技术背景
β-内酰胺酶（β-lactamase；EC3.5.2.6）属于细菌酶蛋白家属的成员之一，29KD 单体蛋白（monomeric）。大 量细菌分泌产生，分布在细菌周边和细菌细胞浆内，通过水解酰胺键（amide bond），分解β-内酰胺（β-lactam） 的 4 原子环状结构，由此产生抗菌素抗性，例如青霉素类、头孢菌素类（cephalosporins）、头霉素类 （cephamycins）、 碳青霉素烯类（Carbapenems）抗性。β-内酰胺酶功能上分成 4 大组，结构上分成 4 大类。 β-内酰胺酶催化反应敏感有效，且容易测试。因此β-内酰胺酶成为崭新的报告基因，替代传统的β-半乳糖苷 酶报告基因系统，可以在活体细胞内实时监测基因转录、检测蛋白间相互作用、评价基因表达载体转染的 效果。基于头孢硝噻吩（Nitrocefin），一种黄色底物，对于所有β-内酰胺酶具有敏感性，在β-内酰胺酶的催 化下，水解产生红色产物，通过 486nm 波长的吸光峰值分析，来定量分析β-内酰胺酶的活性。
B-内酰胺酶的检测方法
（是否产生抑菌圈）
1 ＋ － － 有
2 ＋ － ＋ 有
3 ＋ ＋ － 无
4 ＋ ＋ ＋ 有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在
自陆桥。
1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm）
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
β-内酰胺酶的活性检测和抑制研究进展
安徽科技学院学报,2021,35(1):1-9Journal of Anhui Science and Technology University0-内酰胺酶的活性检测和抑制研究进展丁 阳，吴琼*,李林*(南京工业大学先进材料研究院，江苏南京210000)摘 要：-内酰胺类抗生素是20世纪的伟大发明之一，拯救了数以万计生命。
然而，随着抗生素临床应用 的普及，由—内酰胺酶导致的致病菌耐药性问题也日益突出。
耐药菌的进化和传播严重影响到人类健康 和全球社会经济发展。
因此，检测/抑制0内酰胺酶的活性对合理使用抗生素、有效治疗感染类疾病具有 重要意义。
目前，特异性检测、抑制！内酰胺酶的相关方法和临床应用已有报道。
本综述主要阐述细菌产 生-内酰胺酶的耐药机理，总结近年来！内酰胺酶荧光探针和抑制剂的发展，以期为今后设计特异性高、 灵敏度强的该类荧光探针和抑制剂提供理论依据，解决抗生素耐药性问题。
关键词：-内酰胺酶;耐药菌；抗生素；荧光探针;抑制剂中图分类号:R1文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号：16738772(2021)01000109DOI ：10. 19608/j. cnki. 1673-8772. 2017. 0913Recent Progress in Detection and Inhibition of the Activity of p-LactamaseDING Yang, WU Qiong * , LI Lin *(Institute of Advanced Materials , Nanjing Tech University, Nanjing 210000, China)Abstract :Lactam antibiotics are generally perceived as one of the greatest inventions of the 20th centu ry, and these small molecular compounds have saved millions of lives. However, upon clinical applica tion of antibiotics, the 0—lactamase secreted by pathogenic bacterias can lead to the gradual development of drug resistance. As a result, detecting and inhibiting the activities of -lactamase are of great value for 2heraionaluseofanibioicsand2he2rea2men2ofinfeciousdiseases1A2presen2(manyspecificde2ec- ionme2hodsandinhibiorsof -lac2amasehavebeendevelopedandappliedinclinicalpracice1In2his review (we describe2he resis2ance mechanism of bac2eria producing -lac2amaseandfur2hersummarize 2hefluorogenicprobesandinhibiorsof -lac2amase 1I2may be valuable2o design fluorogenic probes wihimprovedseleciviy (sensiiviy (ande f eciveness2ofur2heridenify2heinhibiorsfor -lac2amases andeven2ua l yovercomebac2erialresis2ance1Key words : 0-Lactamase; Drug-resistant bacterias; Antibiotics; Fluorogenic probes; Inhibitors收稿日期：2021-01-02基金项目：国家自然科学基金项目(81672508)；江苏省研究生科研与实践创新计划(KYCX-1056) +作者简介:丁阳(1996 — )男，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事小分子荧光探针对蛋白质尖性的检测与调控研究+通信作者:吴琼,副教授,E-mail : iamqwwi @njtech. edu. in ；李林，教授,E-mail : iamlli @njtech. edu. cno2安徽科技学院学报2021年1背景抗生素的诞生在现代医学发展史上具有里程碑的意义，也是最成功的药物之一+这些小分子化合物在感染性疾病的治疗中发挥着重要作用，挽救了数百万人的生命⑴+常用的抗生素包括'内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类等2。
原料乳中β-内酰胺酶的检测
１ ３ 一 内酰胺 酶 。 四 、色 谱 法
五 、其他检测方法 免疫 生物 传 感器 。酶 传 感 器依 赖于 酶 高效 液 相 色谱 法是 目前 被广 泛 应 随 着 生 物 化 学 技 术 的 不 断 进 催 化 反应 的专 一 性 ，通过 检 测 反 的 用 的 一种 理化 检 测方 法 ，分 直接 法 和 步 ， １ ３一 内酰 胺 酶 的检 测 技 术 不 断 发 产 物或／ 和底 物 ，得 到抗生 素 的含量 。
接 判 断 牛奶 中是 否 有 １ ３一 内 酰胺 酶
ｍ 的是抗 生 素 的残 留。 为 了掩蔽抗 生 崔生 辉 等运用 此 原理 建 立 了该酶 的检 留。结 果 表 明 ，当酶 浓度 大 于３ ０ ｕ 索 的使用 ．一些 法分 子在 原料 乳 中 测 厅法 ，该 方法 在 牛奶 中的检 ｆ ｝ Ｊ 限 为 升时 ，可 以用 直接 碘 量法 埘其 进 行 添加 ６一内酰 胺 酶这 一物 质 ，以 降 解 ４ Ｕ ／ 毫升 （ Ｕ为酶 的活 力单位 ）。 性 分 析 ，Ｈ ｊ 间接滴 定 法对 其进 行 定 已使 ｆ ｝ Ｊ 的 抗 素 ，使 之 无 法 俭 出 。 陔 疗法 准确 灵敏 、应用 广 泛 ，但 分析 。
们生 活 中不 可或 缺 的天 然食 品 。高 品 青 霉 素作 为对 照 ，通 过 比对加 入 １ ３一 中规 定 的 检 测 １ ３ ～ 内酰胺 酶 活性 的 质 、无 污染 的牛 奶在 增 强 同民 身体素 内酰胺 酶抑 制剂 与 未加 入抑 制剂 的样 法 。 谢 岩 黎 等 采 用 碘 量 法 对 牛 奶 质 中起着 重 要作 埚 ： 当前 乳 及乳 制 品 品 所产 生 的抑制 圈 的大 小来 问接 测 定 的 Ｂ一 内酰 胺 酶 定 性 、定量 分析 ， 质量 安 全仍 存在 一 定问 题 ，其 中最 突 样 品 是 否 含有 Ｂ一 内 酰胺 酶 类 药 物 。
内酰胺酶实验报告
一、实验目的1. 了解内酰胺酶的生物学特性及活性测定方法。
2. 掌握内酰胺酶活性测定的实验操作步骤。
3. 通过实验，加深对内酰胺酶的认识，为相关研究提供实验依据。
二、实验原理内酰胺酶（β-内酰胺酶）是一种水解β-内酰胺类抗生素的酶，具有广谱的抗菌活性。
本实验采用比色法测定内酰胺酶活性，通过测定底物（如苯甲酰甘氨酰苯甲酸）水解产物的生成量来反映酶的活性。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌种、菌液、菌粉等。
2. 试剂：苯甲酰甘氨酰苯甲酸（Benzoyl-L-phenylalanyl-L-arginine, BAPNA）、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-β-D-glucosamine, NAG）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、盐酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 制备菌悬液：将大肠杆菌菌种接种于LB培养基中，37℃培养过夜。
取适量菌液，用无菌生理盐水稀释至10^-5倍，备用。
2. 制备酶反应体系：取0.5 mL菌悬液，加入0.5 mL 50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）、0.5 mL 0.5 mmol/L BAPNA底物溶液，混匀后立即于波长405 nm处测定吸光度。
3. 测定酶活性：每隔一定时间，重复测定吸光度，计算酶活性。
4. 数据处理：以酶活性对时间为坐标绘制曲线，求出酶的半衰期（t1/2）。
五、实验结果与分析1. 实验结果（1）酶活性随时间变化曲线（2）酶活性计算结果2. 实验分析（1）从酶活性随时间变化曲线可以看出，内酰胺酶活性在实验过程中呈先上升后下降的趋势，说明酶活性存在一定的时间依赖性。
（2）根据酶活性计算结果，得出酶的半衰期为30分钟，说明内酰胺酶的活性较高。
（3）与文献报道相比，本实验所得酶活性结果与其基本一致，表明实验操作规范，结果可靠。
六、实验结论1. 成功制备了内酰胺酶菌悬液，并测定了其活性。
2. 通过比色法测定内酰胺酶活性，验证了实验方法的可靠性。
紫外分光光度法检测金属β-内酰胺酶活性的研究
紫外分光光度法检测金属β-内酰胺酶活性的研究沈祝飞;周冰;张加慧【摘要】目的建立以紫外分光光度法检测金属β-内酰胺酶活性的方法.方法采用以美罗培南作反应底物,中性羟胺与硫酸铁胺为显色体系,通过紫外分光光度计检测反应液中美罗培南剩余量计算金属β-内酰胺酶的分解量,从而计算出其酶活性.结果美罗培南的浓度在1～5mg/mL范围内,线性良好,相关系数大于0.999.该方法检测限为0.05U,回收率在90％～119％范围内,重复性相对标准偏差为6.1％～8.7％.检测出的酶活性与酶蛋白含量成正相关.结论该方法能有效区分金属β-内酰胺酶与非金属β-内酰胺酶,并准确反应金属β-内酰胺酶分解碳青霉烯类抗生素的能力.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2015(040)012【总页数】4页(P930-932,937)【关键词】金属β-内酰胺酶;羟胺法;美罗培南;酶活性【作者】沈祝飞;周冰;张加慧【作者单位】杭州北望生物技术有限公司,杭州310015;杭州北望生物技术有限公司,杭州310015;杭州北望生物技术有限公司,杭州310015【正文语种】中文【中图分类】R978.1+1《中国药典》(2010版)二部附录Ⅺ H无菌检查法规定的β-内酰胺类抗生素供试品处理方法中，要求用β-内酰胺酶来处理供试品，以便消除β-内酰胺类抗生素的抑菌性，排除其对无菌检查结果的影响，避免造成假阴性的判断。
金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)是β-内酰胺酶的一种，它可以特异性水解碳青霉烯类的β-内酰胺类抗生素，主要用于β-内酰胺类抗生素无菌检查用供试品的中和剂，尤其是碳青霉烯类抗生素的专属中和剂。
目前，《中国药典》(2010年版)中只规定了β-内酰胺酶中的青霉素酶活性检测的碘滴定法，并没有针对MBL酶活性检测的方法。
碘滴定法所用的底物是青霉素，不能真实反映MBL酶分解碳青霉烯类抗生素的活性。
本文以美罗培南作反应底物，美罗培南可快速与中性羟胺反应，生成羟肟酸，然后与硫酸铁胺形成水溶性内络盐而显红色，在515nm处有最大吸收峰，反应原理如图1[1-2]。
一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法
一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法
1. 凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法是一种用于测量细菌中β-内酰胺酶酶活性的方法，它可以通过测量底物的降解速率来确定酶的活力。
2. 酶活力定量检测方法最常用的底物是含有β-内酰胺环的化合物，例如酶对其进行水解产生胺类产物。
许多酶活性检测方法使用人工合成的底物，例如酚红，其水解生成的胺类产物可以通过吸光度测量来确定酶活力。
3. 该方法的原理是，在凝胶培养基中，添加一定浓度的底物，并培养一段特定的时间，然后通过测量培养基中胺类产物的浓度变化来获得酶的活力。
4. 实验首先制备含有合适浓度底物的凝胶培养基样品，并将其分配到培养皿中。
然后将待测的菌株接种于培养皿中，并在一定温度下培养。
5. 在培养一定时间后，可以使用薄层层析法将培养基中的胺类产物与底物分离。
通过比较样品与标准品在层析板上的迁移距离，可以确定胺类产物的浓度。
6. 利用分光光度计测量胺类产物的吸光度，通过构建标准曲线，可以得到吸光度与胺类产物浓度的线性关系。
然后根据酶水解底物产生的胺类产物的浓度变化来确定酶活力。
7. 在进行实验时，需注意控制培养温度、培养时间和培养基pH等因素，以确保实验结果的可靠性。
8. 该方法相比其他方法具有较高的灵敏度和准确性，用于研究β-内酰胺酶的特性和抗生素抗性机制具有重要意义。
9. 在实际应用中，该方法可以用于筛选抗生素敏感性菌株和评估β-内酰胺酶抗性的传播情况。
10. 酶活力定量检测方法在药物研发和临床药物监测中具有广泛的应用前景，有助于指导临床用药和制定治疗方案。
-内酰胺酶的检测方法
-内酰胺酶的检测方法
内酰胺酶是一种酶，在细胞中起着重要的生物催化作用。
内酰胺酶的功能与细胞的代谢、信号调节和细胞凋亡等过程密切相关。
因此，对于内酰胺酶的检测方法具有很大的研究意义。
常用的内酰胺酶检测方法包括：
1. 活性测定法：通过测定内酰胺酶的催化活性来确定其含量，常用的测定方法有亚甲蓝法、苏丹Ⅲ法和三氯乙酸法等。
这些方法通过观察酶催化产生的颜色、光谱或其他物理性质的变化，来间接或直接测定内酰胺酶的活性。
2. 免疫测定法：利用特异性抗体与内酰胺酶结合来检测其含量。
包括免疫沉淀法、免疫层析法、免疫荧光法和酶联免疫吸附测定法等。
3. 基因表达测定法：通过检测内酰胺酶的编码基因的转录水平和翻译水平来推测其含量。
常用的方法包括实时荧光定量PCR、Northern blotting和Western blotting等。
4. 代谢产物分析法：通过分析内酰胺酶代谢产物的含量来间接推测其活性和含量。
例如利用质谱分析法测定内酰胺酶代谢产物的质谱图谱，从而推测其含量和活性。
综上所述，对于内酰胺酶的检测可以采用活性测定法、免疫测定法、基因表达测定法和代谢产物分析法等不同方法，根据研究的目的和要求选择合适的方法进行检测。
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β-内酰胺酶及其活力测定法
培养基胨15g甘油50g氯化钠4g0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml枸橼酸钠5.88g20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml磷酸氢二钾4g肉浸液1000ml
混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。
酶溶液的制备
取蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。
酶活力测定法
青霉素溶液
称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。
青霉素酶稀释液
取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。
测定法
精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。
空白试验
取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。
按下式计算：
E＝(B－A)×M×F×D×100
式中
E为青霉素酶活力，（单位／ml）／小时；
B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；
F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数；
D为青霉素酶溶液的稀释倍数。
［附注］
磷酸盐缓冲液(pH7.0)
取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。
醋酸钠缓冲液(pH4.5)
取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀。