目的基因的制备基因文库法
目的基因的4种获取方法
目的基因的4种获取方法
1、从基因文库中获取目的基因；
2、cDNA文库；
3、反转录法；
4、人工合成法。
目的基因，也称靶标基因，是指在实验中研究或操纵的特定基因。
在基因克隆过程中目的基因就是要分离、纯化、克隆并转化到生物体的那个可以带来预期表型性状如抗虫或耐除草剂的基因。
目的基因获得方法是取得含有所需生物学功能或编码所需产物结构基因的DNA片段的方法。
1969年贝克威思等从大肠杆菌中分离出了乳糖操纵子DNA，以后有不少科学家用生物学方法、物理化学方法分离出许多纯化的基因。
但总的来看为数不多。
1970年首次完成了77对碱基的酵母丙氨酸tRNA基因的全合成；1973年又合成了126对碱基的酪氨酸tRNA的结构基因。
但上述两次合成的基因都不能得到表达。
1976年8月成功地合成了能表达功能的人工基因——193对碱基的大肠杆菌酪氨酸tRNA基因。
自此以后人工合成基因的报道不断出现。
目的基因的制备基因文库法ppt课件
组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46
目的基因的制备和基因克隆的筛选
contents
目录
• 引言 • 目的基因的制备 • 筛选策略与方法 • 实验结果与数据分析 • 结论与展望
01 引言
目的基因的重要性
决定生物性状
目的基因是生物体内控制特定性 状表达的关键基因，其序列和表 达水平直接影响生物的表型特征。
潜在应用价值
目的基因往往与生物体的生长、 发育、代谢等关键过程密切相关， 因此具有潜在的应用价值，如用 于基因工程、生物制药等领域。
限制性内切酶酶切分析
利用限制性内切酶对DNA进行酶切，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小和数量，判断 目的基因是否插入到载体中。
Southern杂交分析
将酶切后的DNA片段转移到固相支持物上，与特异性探针进行杂交，通过放射自显影 或化学发光等方法检测杂交信号，确定目的基因的存在和位置。
PCR筛选
菌落PCR筛选
05 结论与展望
实验结论总结
成功制备了目的基因
通过PCR扩增和基因合成等方法，成功获得了所需的目的 基因片段，为后续实验提供了基础。
建立了基因克隆筛选体系
通过构建重组质粒、转化宿主细胞、筛选阳性克隆等步骤， 成功建立了基因克隆的筛选体系，为后续基因功能研究提 供了有效手段。
验证了基因功能
通过基因表达分析、蛋白互作研究等方法，初步验证了目 的基因在细胞中的功能和作用机制。
重组DNA的转化与扩增
重组DNA的转化
将重组DNA分子导入到合适的宿主细胞中，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等，使其获得新的遗传特性 。
重组DNA的扩增
通过选择培养基筛选阳性克隆，并进行扩大培养，以获得足够的重组DNA分子用于后续实验。同时， 可以通过PCR等方法对重组DNA进行进一步验证和鉴定。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
DNA文库的构建和目的基因的筛选
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
胰岛素目的基因的获取方法
胰岛素目的基因的获取方法一、基因文库法基因文库法是一种通过构建基因文库来获取目的基因的方法。
基因文库是指将基因组或特定基因的DNA片段克隆到表达载体上，形成的基因重组分子集合。
通过筛选文库，可以获得特定的目的基因。
基因文库法包括基因组文库和cDNA文库，其中cDNA文库构建较为简单，应用更为广泛。
二、化学合成法化学合成法是一种通过化学手段合成目的基因的方法。
在已知目的基因序列的基础上，利用DNA合成仪，按照碱基互补配对原则，合成目的基因的DNA片段。
化学合成法的优点是快速、准确、特异性高，适用于小片段DNA 的合成。
但是，对于大片段DNA的合成，化学合成法存在难度和限制。
三、RT-PCR法RT-PCR法（逆转录-聚合酶链式反应）是一种通过逆转录和PCR技术获取目的基因的方法。
该方法首先将RNA逆转录为cDNA，然后利用PCR技术扩增目的基因片段。
RT-PCR法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，广泛应用于基因克隆、基因表达和基因突变研究等领域。
四、基因定点诱变技术基因定点诱变技术是一种通过诱变手段获取目的基因的方法。
该方法利用定点诱变技术，如寡核苷酸定向诱变技术（ODT）和锌指核酸酶技术（ZFNs），对特定基因位点进行突变，从而获取具有特定变异特征的目的基因。
基因定点诱变技术广泛应用于基因功能研究和遗传性疾病治疗等领域。
五、基因重组技术基因重组技术是一种通过构建重组载体获取目的基因的方法。
该方法将目的基因插入到载体中，形成重组分子，然后将重组分子导入到宿主细胞中，通过筛选和分离，获得含有目的基因的表达产物。
基因重组技术广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质工程等领域。
六、基因合成技术基因合成技术是一种通过合成手段获取目的基因的方法。
该方法利用化学合成或酶促合成技术，按照目的基因的序列，合成完整的基因片段。
基因合成技术具有快速、准确、特异性高等优点，适用于小片段DNA的合成，广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质工程等领域。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
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4.46基因组(genomic library)
2/46
基因组DNA 限制性内切酶
分离基因组DNA
基因重组
DNA片段与载体连接
体外包装
导入细胞
转化细菌
筛选
3目的基因的重组克隆的概率。
如果满足两个条件：生物体染库的完备性就是1。用基因组的克隆数表示基因组的大小即库容量。
5/46
基因库是通过重组技术转化筛选而建立， 利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、 繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体， 把人类等高等生物的基因或其片段重组其中， 成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因 库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和 纯化。6/46基因组的质量评价和完备性25/46
cDNA的质量评价mRNA根据其在细胞中的拷贝数即丰度 低丰度：拷贝数在1至15间 中等丰度：拷贝数在100至1000间 高丰度：拷贝数在1,000至10,000间
高丰度mRNA的cDNA 克隆所占的比例高，分离容易， 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例低，用探针筛选特定A 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组各DNA片段克隆的集合体.
殖.
20/46
mRNA分离纯化 反转录合成cDNA 构建cDNA筛选目的基因21/46
反转录合成单链cDNA
22/46
置换合成法合成cDNA第二链
23/46
引物-衔接头法合成cDNA第二链
24/46
包含着细胞全部mRNA信息的有一部分 表达，且在不同条件、不同分化时期的细胞其基 因表达的种类和强度也不尽相同，cDNA具有 组织细胞特异性。8/46
2.经验值
ln(1－P) N=， 一般 设为99％（0.99）；
f为载体容量（kb）DNA,理论上应具有的最少克隆数；
9/46
人单倍体DNA总长为3×109bp 若载体装载量为15kb 则构建完备性为 0.9 的基因组7/461.理论值
基因组的克隆数目（N）＝基因组DNA总长
DNA插入片段的平均长度
某种生物基因组DNA总长度为3×106 kb，酶切后的 b= 2×105个2/46
可获得的基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
15/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
18/46
polyT亲和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ析法
polyT polyT polyT
AAA AAA
AAA AAA19/46cDNA的组建mRNA反转录酶
1.mRNA提取
2.cDNA合成
基因重组
cDNA cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
3.双链cDNA的分子克隆
4.双链cDNA克隆进质粒或
噬菌体载体并导入宿主中繁
构建大肠杆菌（4.采用质粒作 为载克隆.
完备性
库容量
0.99 0.999 0.9999
92万 138万 184万
基因组（bp）
10kb（质粒）
理论值
经验值
25kb（噬菌体）
理论值
经验值
45kb（粘粒）
理论值
经验值
大肠杆菌
4.6×106
4602116cDNA代表性指中包含的重组cDNA分子反映来源 细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性，胞中表达出的mRNA种细胞中某种mRNA的拷贝数。
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
16/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
17/46
mRNA的提取与纯化
尿素-氯化锂法 硫氰酸胍法 polyT亲和层析法 密度梯度离心分级法 探针筛选法
184
845
102
468
酿酒酵母
1.8×107
1800
8287
720
3313
400
1840
水稻
5.7×108
57000
262492
22800
104996
12667
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
11/46
选择载体的主要参数是基因组大小