第四章 目的基因的制备、连接、导入与基因文库的构建
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
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5‘
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5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
基因文库的构建与使用
基因工程中，需要将某种生物的遗传信息贮存在 可以长期保存的稳定的重组体中，通常是将目的基因 用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬 菌体等载体上，克复杂的染色体ＤＮＡ 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的 基因组中将其活跃的化学能储存在ＡＴＰ
中；暗反应是利用光反应产生的ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ把Ｃ０２ 合成糖类等有机物，同时把ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ中活跃的化 学能转变成稳定的化学能贮存在有机物中。 ２．２细胞呼吸生物体的生命活动都需要消耗能量， 这些能量来自生物体内的糖类、脂质和蛋白质等有机 物的氧化分解。细胞呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两 种类型。有氧呼吸主要在细胞的线粒体中进行，１ｍｏｌ 葡萄糖彻底氧化分解共释放２８７０ｋｊ的能量，其中有 １１６１ｌ【Ｊ左右的能量储存在ＡＴＰ中，其余的能量都以热 能的形式散失了；无氧呼吸释放的能量比有氧呼吸要 少得多，例如，１ｍｏｌ葡萄糖在分饵成乳酸以后，共释放 出１９６．６５ＩｃＪ的能量，其中有６１．０８ｌ【Ｊ的能量储存在 ＡＴＰ中，其余的能量以热能的形式散失了。
・・・・・・・・・・・・・＋？＋・・・・・・・・・・・・・・・・ｔ・・・・・・・・．Ｈ・◆・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・◆－・・・・・。＋＋・位点及选择标记，还具有控制基因表达的序列（如启动子、ＳＤ序 列、Ａ’ｒＧ、终止子等），可在宿主细胞中表达出克隆片段 的编码产物。表达载体又有融合蛋白表是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可 蛋白质具有 抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。◆
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。生物体全部基使之成为一定大小的片物组织中分离出纯化的基因组ＤＮＡ，用限 制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的ＤＮＡ 片段；②ＤＮＡ片段与载体连接。常用噬菌体ＤＮＡ作载 体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源 ＤＮＡ片段。用限制性内切酶切割载体ＤＮＡ，使载体形 成与外源ＤＮＡ相匹配的黏性末端。再用ＤＮＡ连接酶 将ＤＮＡ片段与载体连接起来，成为重组ＤＮＡ；③重组 ＤＮＡ的转化和克隆。将重组ＤＮＡ导入受体菌中，进行 体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒ＤＮＡ组ＤＮＡ克隆，因此 利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所 需要的目的基因片段的重组克隆体。
一般生物制药的主要流程
一般生物制药的主要流程如下：1. 上游阶段1.1 目的基因的制备目的工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种. 为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出用于克隆的次类基因,这样的基因称之为目的基因. 基因工程中获得的目的基因主要用于: (1).研究该基因,分析其结构,功能和表达的调空机制(2).和正常基因比较,找出基因的异常点,探索疾病发生的分子生物学基础.(3).研究生物种系的进化(4).建立基因疗法,将正常基因引入病人体内,治疗遗传性疾病(5).大量表达某种基因,生产出需要的蛋白和多肽(6).对某些基因进行改选,改良动植物品种.不同基因组类型的基因组大小不同,基因组和基因排列也各不相同,因此,分离目的基因应采用不同的途径和方法1.1.1 构建cDNA基因文库分离法cDNA文库是以真核细胞中分离纯化出所有的mRNA,在以mRNA为模板合成cDNA与适当的载体重组转入宿主细胞,这样建立起来的cDNA重组分子集合体称为cDNA文库.而cDNA 文库中插入片段的总和可代表某一种生物全部的mRNA序列.1.1.1.1 cDNA文库的构建构建cDNA文库主要包括以下步骤: (1).细胞总RNA的制备及mRNA的分离(2).以mRNA 为模板,合成cDNA第一条链(3).双链cDNA的合成,而将mRNA—DNA杂交分子转变为双链cDNA分子(4). CDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及传染或质粒的转化等1.1.1.2 cDNA克隆的优越性自20世纪70年代初说创cDNA克隆问世以来,以采用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了许多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也长以cDNA为探针从基因文库中分离相应的基因克隆.因此, cDNA克隆常常以基因分离和结构分析的着手点,在分子生物学研究和基因工程应用等方面具有十分重要的意义.1.1.2 构建基因组文库分离法1.1.2.1 基因组文库的概念将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,分别与适合的载体重组后导入宿主细胞,这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列.这种通过重组,克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组文库.1.1.2.2 基因组文库的大小克隆片段的平均大小/bp 基因组的大小/bp2×10^6(细菌) 2×10^7（真菌）3×10^9（动物）LN SJ LN SJ LN SJ5×10^3 400 1831 4000 18418 600000 273611010×10^3 200 919 2000 9208 300000 138155020×10^3 100 458 1000 4603 150000 69077440×10^3 50 278 500 2300 75000 345386一个理想的基因组文库因该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列.这就要求在打断基因组DNA时尽可能做到随机切割,实际上,无论采用什么方法的不能达到理论上的切割.应此构建的基因组文库应包含的克隆子数理论值和经验值之间相差比较大.几类基因组文库的大小见下表: 「2」1.1.2.3 构建基因组文库的类型通过克隆,重组方法构建的基因组文库主要有：(1)构建λ噬菌体基因组文库；（2）构建考斯质粒基因组文库(3) 构建Y AC基因组文库1.1.3 直接分离法1.1.3.1 限制性核酸内切酶酶切分离法限制性核酸内切酶酶切分离法适于简单基因组中分离目的基因.质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基,大的也不超过几万碱基,编码的基因较少,获得的目的基因方法比较简单. 1.1.3.2 基因分离的物理化学法这是基因工程在发展初期所用的方法,某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的,但目前很少采用.次方法主要有：密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等.1.1.3.3 双抗体免疫法分离编码蛋白的基因双抗体免疫法分离编码蛋白的基因适于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化,且足以产生抗体.1.1.3.4 利用酶促反转录发直接从特定mRNA分离基因酶促反转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离目的基因.目的基因的mRNA为模板逆转录酶cDNA DNA聚合酶双链双链cDN**段与合适载体重组并转入受体菌cDNA克隆1.2 目的基因的分离通过适当的方法构建上一个完整的基因组DNA文库或CDNA文库,意味着包含目的基因在内的所有基因都得以克隆,但并不等于完成了目的基因的分离.因为在基因文库中,不论是CDNA文库还是基因组文库,含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个,其中究竟哪个克隆子含有我们所需要的目的基因序列还不清楚.因此,还需要下一个步骤要进行的就是目的基因的分离,主要方法有：（1）目的基因的功能克隆（2）序列克隆法（3）利用差示分析法分离目的基因克隆（4）功能结合法筛选目的基因（5）DNA插入诱变法分离目的基因（6）应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因（7）基因的定位侯选克隆法（8）染色体显微切割与微克隆法（9）根据生物大分子内的相互作用分离目的的CDNA克隆（10）筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术1.3 基因克隆载体载体是携带目的基因的DN**段进入受体细胞进行扩增和表达的工具.常用的载体是经过改造的细菌质粒,噬菌体,黏粒和病毒1.3.1 质粒克隆载体质粒是细菌染色体外的双链环状的能自我复制的小分子DNA,其对细胞本身的生长繁殖不是必需的,但可以赋予细菌一定的类型,如耐热型等.与构建克隆载体相关的质粒性质有：（1）粒的复（2）制型（2）质粒的不（3）相容性（3）质粒的接合性（4）质粒作为基因工程载体需要具备的条件：作为基因工程载体的质粒都是经过人工改造过的质粒,具备以下特点：a, 相对分子质量小3—10kb b, 是松弛型复制质粒c, 是非接合型质粒c, 质粒上有多个限制酶的单一切点d, 带有双选择标记1.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成,经包装后成为病毒颗粒.通过感染,病毒颗粒进入宿主细胞,利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制的壳蛋白质的合成,实现病毒颗粒的增殖.人们利用这些性质构建了一小列分别适用于不同生物的病毒克隆载体.通过此种方法构建成的基因克隆载体主要有：（1）噬菌体克隆载体cosmid克隆技术（黏粒）（2）Μ13噬菌体克隆载体（2）aMV克隆载体（4）烟草花叶病毒（TMV）载体克隆（5）SVCO克隆载体（6）反转录病毒克隆载体（7）腺病毒克隆载体（8）痘苗病毒克隆载体（9）杆状病毒表达克隆载体1.3.3 其他类型的克隆载体（1）染色体定位整合克隆载体（2）人工染色体克隆载体（3）特殊用途克隆载体：如启动子探针型,（4）诱导型,（5）反义表达组织特异表达,（6）分泌型表达,（7）双启动子,（8）串族启动子和含增强子表达克隆载体等等1.4 目的基因和载体的连接（重组）目的基因和载体连接前要先用同一种限制酶将目的基因和载体切割成黏性端或平端,也可以用物理方法切割后再用酶补成平端体外连接是基因工程的重要环节,体外连接要减少载体的自身环化,提高重但子阳性率.主要的连接方法有：黏性末端连接、平端连接、定向插入和同源多聚尾.1.5 重组体导入受体细胞外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组的DNA分子.该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞在中才能使外源目的基因得以大量扩增或表达.随着基因工程的发展,从低等的原核细胞,到简单的真核细胞,进一步达到结构复杂的高等动,植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞.选择适宜的受体细胞已经成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一1.5.1 受体细胞的选择要求目的基因获得后,必须在合适的宿主细胞中才能进行表达,才能获得目的产物.应此,宿主细胞必须满足:容易获得较高浓度的细胞;能利用易得廉价的材料;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行DNA重组技术操作技术;产物的产量、产率高,产物容易提取纯化.1.5.2 受体细胞的类型人们通过研究,根据需要获得了一定的目的产物,而目的基因能否的到有效的表达,关键在与受体细胞的选择.1.5.2.1 原核生物细胞由于原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的优点,而且人们对其遗传背景清楚,所以早期开展的基因工程操作,都是以原核生物为受体细胞.目前研究比较多的有:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等.1.5.2.2 真核生物细胞由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂,适用于原核生物的转基因方法大多数难以有效地用于真核生物.近年来经过探索,发现它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性.并用这些方法有效的获得了转基因真核生物.研究较多的有:酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等等.1.5.3 重组子的筛选在重组DNA分子的转化、转染和转导过程中,并非所有的的受体细胞都能被导入重组DNA 分子.一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖.因此,如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来,然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和工程操作红极为重要的环节.重组子的筛选可以根据载体的类型、受体细胞种类以及外源DNA分子导入受体细胞的手段等采用不同的方法,一般包括以方面:(1).遗传直接筛选法; (2),核算分子杂交检测法; (3)依赖于重组子结构特征分析的筛选法; (4)免疫化学检测法; (5)转译筛选法; (6)亚克隆法; (7)插入失活法;(8)电子显微镜作图检测法; (9)基因表达产物分析法; (10)DNA序列分析法.1.6、外源基因的表达基因工程技术的核心是基因表达技术.迄今为止,已构建了多种基因表达系统,包括原核生物和真核生物基因表达系统,不同的表达系统具有各自的特点.1.6.1 基因表达的机制（过程）1.6.1.1 外源基因的起始转录外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题,而外源基因的起始转录又是基因表达的关键.1.6.1.2 mRNA的延伸与稳定性外源基因起始转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键. mRNA的稳定性直接导致决定翻译产物的多少,对原核细胞来说,最佳的方法是选择一个RNase缺失受体前.对真核细胞来说则需考虑增加mRNA的正确加工,提高成熟mRNA的稳定性.1.6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译翻译是mRNA指导多肽链生成的过程,翻译的起始是多种因子协同作用的过程,其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之间的碱基配对,还有mRNA序列上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响.1.6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素,因此,为了避免此现象的发生可从以下几个方面考虑：（一）构建融合蛋白表达系统; （二）构建分子体蛋白表达系统;（三）构建包涵体表达系统; （四）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.1.6.1.5 目的基因沉默基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素.它的作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默.基因沉默现象主要表现在转基因动物和植物中.目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA,DNA与RNA,RNA与RNA相互作用的结果.由于重复序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一,因而在构建表达载体时,应尽可能避免与内源序列具有较高的同源性.此外,可以通过选择甲几基化酶活性较弱的受体细胞或以化学物质处理受体细胞抑制甲基化作用.1.6.2 基因表达的调控元件通过研究发现主要的基因表达调控元件有：启动子、增强子、终止子、衰减子、绝缘子和反义子1.6.3 外源基因表达系统外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞,并能在其中有效的表达,产生目的基因产物（目的蛋白）.由此可知,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成.基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统.目前,利用较多的是原核生物表达系统,因其遗传背景清楚,繁殖快,表达率高等特点.近年来,真核生物基因表达系统发展很快,因其可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性等优点.目前主要应用的表达系统有：大肠杆菌基因表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞基因表达系统、植物细胞基因表达系统；还有最新研究的两个新的表达系统[3]：巴斯德毕赤酵母表达系统和动物乳腺生物反应器——全新的生产模式.2、下游阶段基因工程只要的过程关键在于上游阶段,因它可以获得有效的工程菌,但下游纯化阶段也必不可少.因此为了获得合格的目的产物,必须建立相应的医药生物技术产品的分离纯化工艺. 2.1、基因工程菌发酵：良好的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要,直接影响下游纯化工艺,形象到产品的质量和生产成本,决定产品在市场上的竞争力.目前,基因工程菌培养常用方法有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定培养.近年来,生物药品已进入生物技术时代,对基因工程菌的培养设备要求十分严格,主要采用新型自动化发酵罐.2.2、分离纯化的基本过程：分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环,这是由于工程菌经过大规模培养后,产生的有效成分含量低,杂质含量高；另外由于基因工程药物是从转化细胞,而不是从正常细胞生产的,所以对产品的纯度要求也高于传统产品,主要的步骤如右表：[4]2.2.1、建立分离纯化工艺根据主要根据：（1）含目的产物的起始物料特点;（2）物料中杂志的种类和性质;（3）目的产物特性;（4）产品质量的要求.2.2.2、选择分离纯化方法的依据：主要依据：(1) 根据产物表达形式来选择;(2) 根据分离单元之间的衔接选择;(3) 根据分离纯化工艺的要求来选择.2.2.3、常用的分离纯化方法（见下表）[5]方法目的离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质(如病毒)阴离子交换层析去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0.22μm微孔滤膜过滤除菌3、基因工程药物：自20世纪80年代初第一种基因工程产品——人胰岛素投放市场以来,以基因工程药物为主导的基因工程应用已成为全球发展最快的产业之一.随着生物技术的快速发展,基因工程药物将拥有越来越广阔的发展前景.基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等,它对预防和治疗人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿疾病等有重要作用.3.1、基因工程激素类药物激素是一类由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机物,通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位,能引起特殊的生理效应.基因工程的激素类主要指通过基因工程方法合成的蛋白多肽类激素.目前被批准上市的激素类药物有胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素等. 3.2、基因工程细胞因子类药物细胞因子是由细胞分泌的能够调节物有机体生理功能,参与细胞的增殖,分化和凋亡的小分子多肽类物质.目前被批准上市的产品有十多种.主要有：干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）,趋化因子和生长因子（GF）等.它们的生物学功能主要表现为：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节机体造血功能和促进炎症反应等. 3.3、基因工程疫苗：直接利用微生物制备疫苗来治疗疾病取得了巨大的成就,但由于各种传染病在世界范围内广泛存在,并不断有新的致病微生物被发现,它们对人类的健康造成巨大威胁.利用基因工程方法制备疫苗对控制传染病的复发和治疗新的传染病有重要意义.目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍乱菌苗、结核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、疟疾疫苗、口蹄疫疫苗. 3.4 特殊基因工程药物—防御素防御素是一类在生物界广泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些恶性细胞抗性的小分子短肽.它的抗性谱十分广泛,目前以发现它不但对细菌、真菌和被膜病毒(如爱滋病病毒)有广泛的毒杀效应,对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用.最近,对一些长期存活的爱滋病感染者的研究发现,他们体内的爱滋病抑制因子就是一类防御素.这一研究发现给人们战胜爱滋病带来希望.4. 基因工程研究发展前景基因工程问世以来短短的二十几年,显示出了巨大的活力,使传统的生产方式和产业结构发生了变化.特别是在医药行业,利用人工的方法合成了许多有用的药物及人体器官等,取得了很大的经济效益.今后,基因工程将重点开展基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面的研究.通过这方面的研究、开发,对人类的生活、生存环境从根本上优化做出巨大的贡献.因此,我们相信基因工程的前景将是更加灿烂辉煌.。
基因文库构建的方法
基因文库构建的方法
1. 嘿，先来说说载体的选择吧！这就好比搭房子选材料，你得挑个合适的呀！比如在构建基因文库时，我们可以选择质粒作为载体呀。
就像建房子有了好砖头，载体选好了，那后续工作才能顺利开展嘛，你说是不是？
2. 然后呢，获取基因片段可不能马虎！这就像是收集宝贝一样，得细心点！从细胞中提取基因片段，哇，这可是关键的一步呢！这不就像是在茫茫人海中找到自己想要的那颗珍珠嘛。
3. 接下来，连接反应可重要啦！这就如同把两块拼图完美地拼在一起。
把基因片段和载体连接起来，形成重组分子，这多有意思呀，就像完成一个精巧的拼接游戏一样！
4. 转化也马虎不得呀！把重组分子导入到宿主细胞中，这就像给它们找个新家。
就好比我们搬家，得找个合适的地方住进去呢，这样它们才能好好生长呀，不是吗？
5. 筛选阳性克隆可不能少！这就好像在一堆苹果中找出最甜的那个。
把含有目的基因的克隆筛选出来，这得多有成就感呀，就像找到了宝藏一样让人兴奋呢！
6. 文库的扩增也很关键哦！让基因文库变得更丰富更大，就像让一个小花园长成一个大花园。
不断地培养壮大，多棒呀！
7. 鉴定也很重要呢！确定基因文库的质量，这就好像给一件宝贝做个鉴定一样。
看看它是不是真的那么好，那么独特，这能让我们心中更有底呀，对吧？
8. 最后呀，优化条件不能忘！就像给汽车调整到最佳状态。
找到最适合的条件，让基因文库构建得更完美，这是必须要做的呀！总之，基因文库构建的这些方法都很重要，每一步都要用心去做，才能得到一个超棒的基因文库呀！。
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
基因工程药物教学大纲
基因工程药物教学大纲课程名称：基因工程药物课程编号：学分：1.5学时数：28考核方式：N+2。
笔记10%，考试成绩占40%，过程成绩N占50%。
先修课程：生物化学、微生物学、基因工程等。
课程说明：专业选修课。
一、课程的性质基因工程技术, 不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化, 而且也给工农业生产和国民经济发展带来了巨大的经济和社会效益, 给人类进步带来了新的契机。
目前，基因工程学正以新的势头继续向前迅猛发展, 成为当今生物科学研究诸领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一, 特别是基因工程在医药生物技术领域中的研究和应用，其意义深远、潜力之巨大。
二、课程的目的与教学基本要求课程目的：为了适应生物工程技术的迅速发展、拓宽专业面, 为了使学生对当今世界生物工程领域日新月异地发展的高新技术有更多的了解, 进一步扩大学生的知识面和视野，同时为他们今后从事这方面的工作和研究打下一定理论基础, 特开设该课程。
课程任务: 通过讲授基因工程制药的概貌及国内外研究进展、基因工程制药常用的工具酶和克隆载体、基因工程药物无性繁殖系的组建以及基因工程药物的生产和质量控制等, 使学生对基因工程的基本理论、基本步骤和操作技术以及基因工程药物的生产技术原理和方法有比较系统的了解, 初步掌握基因工程制药有关基本知识。
三、课程适用专业本课程适用于生物技术专业等相关专业。
四、教学内容、要求与学时分配第一章基因工程制药概述( 2学时)第一节：基因工程的概貌简述基因工程的诞生和兴起，基因工程的定义、特点与基本步骤，基因工程早期的开创性研究成就，基因工程的应用与发展趋势等。
第二节：基因工程与生物制药简述基因工程药物的研究和发展概况，介绍应用基因工程和蛋白质工程技术研究开发的几种新型基工药物。
第二章基因工程制药常用的工具酶( 2学时)第一节：限制性核酸内切酶简述限制酶的发现、限制酶的种类、限制酶的命名和限制酶的特性与用途等。
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AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
引物
G 5‘ppp’5 G
退火
AAAAAAAOH 3’
逆转录酶
G 5‘ppp’5 G
dNTPs
TTTTTTTTTTTTTTp
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
cDNA第一链
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
鸟枪法克隆的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时
必须考虑下列问题：
生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间
脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G 碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用 腈乙基保护)
连接臂
1.3 DNA化学合成的用途
合成天然基因
如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 基因等
修饰改造基因
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
设计新型基因 制备探针、引物、接头
5’ A 5’ T T7 lacZ MCS ori Apr A 5’ T 5’ PCR扩增产物
T 载体
3 cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA第一链的合成
mDNA
G 5‘ppp’5 G
鸟枪法操作的改进
在连接前将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼
脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于
1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接
2.0 kb 1.8 kb
1.6 kb
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ T4-DNA ligase TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’5 G G
RNaesH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ S1 5’ 3’ 5’ 5’
探针内部不应出现可能的互补区域
探针等寡聚核苷酸合成
某段连续的氨基酸序列
所有可能的DNA序列
CysMetAsp Glu Met Lys Arg Asn Ile
TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T 设计的简并探针序列 C CGA TGTATGGACGAIATGA CGG TGTATGGATGAIATGA CGT TGCATGGACGAIATGA CGC TGCATGGATGAIATGA A expressed sequence tag G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计
目的基因设计需要考虑的问题
基因的长度及引物的设计 限制性酶切位点的去处与添加 去除基因内部正反向重复序列 使用宿主偏爱的密码子
添加起始与终止密码子
添加表达所需特殊序列，如信号肽、调整阅 读框、核糖体结合位点等
目的基因制备方法
化学合成法 PCR法 cDNA法 鸟枪法
1 化学合成法
化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途
3‘ HO
G 5‘ppp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTTp 5’ Klenow dNTPs
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
cDNA法克隆目的基因的基本战略
2 PCR法
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物
cDNA法分离目的基因的基本程序
特异分离程序
提 取细胞总 mRNA，琼 脂 糖凝胶 电 泳分离 ， 回收目标
mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
差异分离程序
利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对 应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因
化学合成的单元操作
DMT： 二甲氧基三苯甲基
亚磷酰胺
DMT
O CH2 H H O O H H N CH Me Me CH Me G H
DMT
O CH2 O H H O H H H N CH G H
激活
Me O P Me
四唑
Me O P Me
Me
CH Me
Me
亚磷酰胺四唑活性中间体
脱取代基
氧化
缩合
碘液 三氯乙酸 玻璃珠
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
cDNA法分离目的基因的基本程序
目的基因
5 ‘ 5 5
5 ‘ 5 ‘ 5
5
‘ 5
变性
加热
‘
聚合
底物
‘ 5 ‘ 5
‘
5
退火
5 ‘
引物
5 ‘
‘
3 1
‘ 5
‘ 5 ‘ 5 ‘
退火
引物
‘
5
5
5
‘
聚合
底物
5 ‘
‘
‘
5
5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘
5
变性
加热
‘
变性
加热
5 ‘
‘
2
5 ‘ 5 ‘
5
5 ‘
退火 引物
5 ‘
聚合
底物
5
‘ 5 5 ‘
‘ 5
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体
；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受
体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受
体细胞
第四章 隆载体的体外重组 重组载体引入受体细胞 重组子的筛选基因的构建第一节 目的基因的制备
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回
愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合 成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片 段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95% 则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
1.1.2 探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸
合成第二链
克隆
单链cDNA
原位杂交
cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
4 鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性
1.1 化学合成法的基本战略
1.1.1 全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链
完备分离程序
提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后
借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法 筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等