载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
DNA的基本分子生物学操作汇总
Sanger测序法利用DNA聚合酶和四种不同脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的特异性，通过分 别标记四种脱氧核糖核苷酸并在不同反应管中分别添加不同的荧光标记，实现DNA序列的逐一合成和检测。该方 法具有高准确性和高分辨率的特点，但测序长度有限制。
下一代测序技术
总结词
DNA的基本分子生物学 操作汇总
• DNA的提取 • DNA的限制性酶切 • DNA的连接 • DNA的转化 • DNA的克隆与表达 • DNA的测序与分析
01
DNA的提取
细胞裂解
机械法
通过机械方式破碎细胞壁，常用的方法有超声波 破碎和玻璃珠研磨等。
化学法
使用化学试剂如盐酸、氢氧化钠等改变细胞膜通 透性，使细胞内容物释放。
离心分离
利用离心机分离酶切产物。
纯化试剂盒
使用纯化试剂盒进行酶切 产物的纯化。
03
DNA的连接
连接酶的种类与特性
EcoRI
T7 DNA Ligase
识别GAATTC序列，切割后产生5'-突 出的粘性末端。
在DNA的5'到3'方向上催化DNA的连 接。
T4 DNA Ligase
能够连接两个DNA片段，形成磷酸二 酯键。
注意事项
感受态细胞的制备需要在无菌条件下进行，避免污染。
DNA的转化过程
转化过程
将制备好的感受态细胞与外源 DNA混合，通过离心、洗涤
和再悬浮等步骤，使外源 DNA进入感受态细胞。
转化效率
转化效率的高低与感受态细胞 的状态、外源DNA的浓度和
纯度等因素有关。
影响因素
转化条件如温度、pH、离子 浓度等也会影响转化效率。
基因工程知识要点
基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。
——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。
——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。
——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。
——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。
——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。
②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。
哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。
（简述寄主控制的限制与修饰现象。
⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。
所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。
R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。
（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定一、实验目的1.CaCl2法制备感受态细胞2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH>12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂1.器材恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂1)用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA (20 ng/ul)2)用BamH I 和Xba I 处理的4.8 kb c-myc DNA 片段(20 ng/ul)3)已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA (5 ng/ul)4)T4 DNA连接酶(5 U/ul)及10X连接酶缓冲液(Thermo公司)5)LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板(含抗生素)6)0.1 mol/L CaCl/溶液7)AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen公司产品)8)无水乙醇9)BamH I (10 ug/ul)及Xbal I (10 ug/ul) (NEB 公司产品)10)10X Buffer 4 (NEB 公司产品)11)1X TAE ( 0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA)12)Y DNA Hind III Markers (0.1 ug/ul) (Thermo 公司)13)6X凝胶加样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40% (w/v)蔗糖水溶液)14)氨苄青霉素储存液(100 mg/ml)15)CelRed 核酸染料(10000X in water) (Biotium 公司产品) 四、实验步骤1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接目的基因片段(4.8 kb)，25 ng/ul 4 ul载体DNA (3.5 kb), 25 ng/ul 4 ul10X buffer 1 ulT4 DNA 连接酶(5 U/ul) 0.5 ulddH2O 0.5 ul总体积：10 ul 混匀，16℃水浴锅温浴2. CaCl 法制备感受态细胞21)取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h,细胞长至云雾状。
DNA体外重组技术介绍
星活性: 酶切反应条件不能满足最适 条件,导致某些酶产生第二活性.
EcoR I*
GAATTC
AATT
酶切反应体系的建立：
标准的酶切体系 1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推 荐的Buffer和温度，反应1h
酶切体系组成
• 内切酶 根据实验目的选择，保存，使 用，稀释（避免失活与污染）
第五章
DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细 胞
或克动 隆物 化（(c常lo被ni成ng为) 副本或拷贝）。 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。
DNA克隆(DNA cloning)
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。
• 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶， 分解X-gal，使菌落为蓝色。
pBR322质粒：一种克隆质粒
结构：
ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。
Ampr, Tetr：
Ampr
两个抗性基因用于
Tetr
筛选阳性克隆。
Pst I, BamH I：
两个单酶切位点用于 ORI 插入目的基因
pfxBlue: 克隆质粒
质粒载体
体 酵母人工染色体
粘性载体
二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)
定义: 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。
染色质 质粒 细菌培养
大肠杆菌
质粒扩增并表达蛋白质
重组dna的技术操作流程
重组dna的技术操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
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实验一载体与目的基因的连接与转化以及
重组DNA的提取与酶切鉴定
一、实验目的
1.CaCl2法制备感受态细胞
2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）
3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）
4.质粒DNA的小量快速制备
5.质粒DNA的限制性内切酶酶切
6.DNA的琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理
通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂
１.器材
恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培
养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂
1）用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA（20 ng/ul）
2）用BamH I和Xba I处理的4.8 kb c-myc DNA片段（20 ng/ul）
3）已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA（5 ng/ul）
4）T4 DNA连接酶（5 U/ul）及10×连接酶缓冲液（Thermo公司）
5）LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板（含抗生素）
6）0.1 mol/L CaCl2溶液
7）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司产品）
8）无水乙醇
9）BamH I（10 ug/ul）及Xbal I（10 ug/ul）（NEB公司产品）
10）10×Buffer 4（NEB公司产品）
11）1×TAE（0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA）
12）γDNA Hind III Markers（0.1 ug/ul）（Thermo公司）
13）6×凝胶加样缓冲液（0.25%溴酚蓝；40%（w/v）蔗糖水溶液）
14）氨苄青霉素储存液（100 mg/ml）
15）CelRed核酸染料（10000×in water）（Biotium公司产品）
四、实验步骤
1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接
目的基因片段（4.8 kb），25 ng/ul 4 ul
载体DNA（3.5 kb），25 ng/ul 4 ul
10×buffer 1 ul
T4 DNA连接酶（5 U/ul）0.5 ul
ddH2O 0.5 ul
总体积：10 ul
混匀，16℃水浴锅温浴
2. CaCl2法制备感受态细胞
1）取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h，细胞长至云雾状。
2）将细胞悬液倒入15 ml离心管，冰浴10 min。
3）4℃，4000 rpm，离心10 min。
4）去上清，在纸巾上倒置1 min。
5）沉淀重悬于冰预冷的1 ml CaCl2（0.1 mol/L），混匀。
6）转入1.5 ml离心管，冰浴10 min。
7）4℃，4000 rpm，离心10 min。
8）去上清，在纸巾上倒置1 min，重悬于120 ul CaCl2（0.1 mol/L），分装为50 ul/管。
3.重组质粒转化感受态细胞
1）5 ul连接产物或阳性对照1 ul分别加入50 ul感受态细胞，冰浴30 min。
2）42℃，90 sec。
3）立即冰浴1~2 min。
4）分别加入LB培养液150 ul，37℃振摇45 min。
5）分别取200 ul实验组和100 ul对照组铺板于含Amp的LB平板。
6）37℃温箱培养过夜。
4.重组质粒的提取
1）将细菌培养物全部倒入15 ml离心管，4500 rpm，5 min，去上清，沥干。
2）加入250 ul Buffer S1，吹打混匀以充分悬浮细胞，转入1.5 ml离心管。
3）加入250 ul Buffer S2，上下颠倒，温和混匀4~6次使菌体裂解。
4）加入350 ul Buffer S3，上下颠倒，温和混匀6~8次，12000 g离心10 min。
5）吸取上清至已置于2 ml离心管的制备管中，12000 g离心1 min，去滤液。
6）同上，在制备管中加500 ul Buffer W1，12000 g离心1 min，去滤液。
7）在制备管中加入700 ul Buffer W2，12000 g离心1 min，去滤液。
8）重复步骤7）一次，再空离心1次。
9）将制备管移入新的1.5 ml离心管，在膜中央加60 ul Eluent或ddH2O（65℃温浴），室温静置1 min，12000 g离心1 min，即为质粒DNA。
、
5.质粒DNA的限制性内切酶酶切
Buffer 4 2 ul
BamH I（20 U/ul） 1 ul
Xba I（20 U/ul） 1 ul
ddH2O 10 ul
质粒DNA 6 ul
总体积：20 ul
混匀后短暂离心，37℃水浴1 h。
6.凝胶电泳
1）准备好制胶器，插好梳子并保证梳子距底部0.5 mm~1.2 mm。
2）准备好凝胶，加热溶解。
3）加入GelRed，灌胶，待凝。
4）在电泳槽内加入电泳缓冲液，拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架放入电泳槽内，保证液面高于凝胶面。
5）加入6×凝胶加样缓冲液和DNA（1：5混合）。
6）依次加样品以及Marker。
7）连通电源，80~100 V电泳至溴酚蓝带到达凝胶1/2处。
8）结果观察和记录。
五、实验结果
1.平板观察
次日取平板观察，可见平板中有单克隆菌落生长，说明转化成功。
将平板于4℃冰箱保存备用。
A B
图1 平板克隆生长情况 A.实验组；B.对照组
2.酶切及电泳结果
电泳结果显示：转化后获得的质粒分子量月8.5 kb，双酶切后获得两端分子量分别为3.5 kb和4.8 kb的片段，与预期结果一致。
该结果表明重组DNA构建成功。
图2 凝胶电泳结果，样品顺序依次为第四组未酶切质粒，双酶切质粒，Marker，第十一组未酶切质粒以及双酶切质粒
六、实验注意事项
1.制备感受态细菌的过程中必须全称保持在冰浴中进行。
这是由于低温可以使细胞膜的流动性降低，有利于DNA的结合，同时使细胞暂停生长，维持在对数生长期的高活性。
2.细菌培养时需将平板倒置。
这是由于培养基中的水分含量较高，在温度较高时容易挥发造成培养基损失，同时，倒置也可以防止蒸发的水分在培养皿盖子上凝结并滴落下来，影响菌落生长。
3.在质粒抽提时，DNA变性复性的过程中，动作要温和轻柔，避免剧烈摇晃。
这是为了防止剧烈摇晃导致剪切力过大，使得染色质DNA以及质粒DNA断裂。
4.在凝胶电泳时，确保每样试剂加入反应体系，加样完成后需混匀并短暂离心，再加凝胶加样缓冲液。
电泳时确保电泳的方向不能弄错，DNA从阴极跑向阳极。
七、实验讨论
在本次实验中，我们通过质粒连接、转化、扩增、抽提获得目的重组DNA，并通过酶切、凝胶电泳实验初步验证了重组DNA及酶切片段的大小。
在连接的过程中，温度保持在16℃，而酶切的过程则保持在37℃。
这是由于较低的温度可以使连接产物的分子结构更加稳定，使连接的效率增加；而37℃是内切酶的最佳酶活性温度，保持37℃可以确保酶切的效率最大化。
在酶切验证这一步，我们选取BamH I和Xba I将重组DNA重新切割为原来连接的两个DNA片段，由于我们在连接时选用的是不同的酶切位点酶切的片段，两端具有不同的粘末端，因而连接的方向是确定的，因此当DNA大小与预期一
致时，便可以验证我们的重组DNA是否成功。
若连接用的DNA片段具有相同的粘末端序列，则可能出现载体或目的基因自我连接，以及目的基因在载体中插入的方向相反等情况，通过平板的抗性筛选可以将目的基因自我连接的部分去除，因为其上不含抗性基因，而载体自我连接的DNA可以通过凝胶电泳的分子质量大小区分。
而目的基因片段连接方向的确定则需要设计新的酶切位点，通过选取载体或目的基因上偏离中心位点的位置进行酶切，从而获得理论上正向插入与反向插入获得大小不同的基因片段，并进行酶切、凝胶电泳验证。
凝胶电泳可以初步验证我们获得的重组基因是否正确连接，若需进一步验证重组DNA的序列是否正确，还需要测序鉴定，以及通过转染实验验证目的蛋白是否能够正确表达。