实验五 目的基因的连接、转化 南开大学分子生物学实验
生物实验： dna连接与转化
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1、ＤＮＡ分子的体外连接
▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的。
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连接反应中值得注意的几个问题：
▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似。
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Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制
▪ Ｔ４连接酶作用分三步：
▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。
▪ ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。
▪ 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前 主要有两种假说： １．局部原生质体化假说 －－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮ Ａ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。
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制备感受态细胞
▪ 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合.
▪ ＤＮＡ分子转化分以下几步: ▪ １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ▪ ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受
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5.连接反应的检测
▪ 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。
▪ 我们下面的实验从粘性末端为例操作。
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▪ 二、实验试剂 ▪ １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ▪ ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer ▪ 200mM Tris-HCl(pH7.6) ▪ 50mM MgCl2 ▪ 50mM 二硫苄糖醇 ▪ 500μl/ml BSA ▪ ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ▪ ４．5mM ATP
2024年《分子生物学实验》课程教学大纲
《分子生物学试验》课程教学大纲课程编号： 05030适用专业：生物工程与生物技术试验学时数：36学时试验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学试验指导》徐庆华等成栋学院立项教材 2024一、课程说明《分子生物学试验》以介绍分子生物学中的试验方法、试验手段和培育学生试验操作技能为其主要内容。
须要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手实力，培育学生分析问题和解决问题的实力。
通过试验，要求学生能在原有的相关理论学问基础上较全面和深化理解分子生物学基本原理，驾驭基本的分子生物学试验方法和技巧，初步具备肯定的试验设计实力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
本试验课在方法上力求经典，试验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。
二、学时安排三、教学内容及教学基本要求试验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、试验特点试验类型：综合试验类别：专业基础安排学时：6 每组人数：2二、试验目的1、驾驭碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。
2、驾驭琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。
3、了解质粒DNA的粗略定量方法。
三、试验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培育基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后马上加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10 min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。
转化连接实验报告
一、实验目的1. 了解转化连接的原理和过程；2. 掌握转化连接的操作步骤；3. 学习检测转化连接结果的方法。
二、实验原理转化连接是指将目的基因与载体连接，并将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因的过程。
转化连接包括DNA连接和转化两个步骤。
1. DNA连接：利用DNA连接酶将目的基因与载体连接，形成重组质粒。
DNA连接酶能够催化两个DNA分子的末端以磷酸二酯键相连，形成完整的DNA分子。
2. 转化：将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因。
转化方法有多种，如电转化、化学转化等。
三、实验材料1. 试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、dNTPs、DNA分子量标准、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳试剂等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计、离心机、移液器等；3. 培养基：LB培养基、氨苄西林等。
四、实验步骤1. 目的基因和载体的制备：利用限制性内切酶分别切割目的基因和载体，获得具有相同黏性末端的DNA片段。
2. DNA连接：将目的基因和载体片段按照一定比例混合，加入DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和dNTPs，在适当的温度下进行连接反应。
3. 重组质粒的制备：将连接反应产物进行PCR扩增，获得目的基因和载体的重组质粒。
4. 重组质粒的鉴定：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察重组质粒的分子量是否与预期相符。
5. 转化：将重组质粒转化至受体细胞中，如大肠杆菌。
常用的转化方法有电转化、化学转化等。
6. 转化细胞的培养：将转化后的细胞在含有氨苄西林的LB培养基中培养，以便筛选含有重组质粒的转化细胞。
7. 阳性克隆的筛选：通过PCR或DNA测序等方法，检测转化细胞中是否含有目的基因，筛选出阳性克隆。
五、实验结果与分析1. 重组质粒的制备：通过PCR扩增获得重组质粒，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR 产物与预期分子量相符。
2. 转化细胞培养：在含有氨苄西林的LB培养基中培养转化细胞，观察细胞生长情况。
南开大学基因操作原理 复习要点
大肠杆菌受体优点：1、易转化；2、可使用多种易操作的载体，宿主范围较大缺点：1、缺少辅助功能的生化途径，这些有利于表型功能的研究，如芳香族的降解、抗生素的合成、致病性、孢子形成等在新宿主中克隆有3个先决条件：1、具有将目的基因导入受体的方法：转化、接合、电穿孔；2、目的基因在受体菌中能稳定存在：以复制子的形式或整合到基因组中、前质粒中；3、目的基因在表达时能被检测到目的基因的导入其他菌的转化特点：1、自然发生，转化能力是一个短暂现象2、在一些菌中，转化是独立序列进行的3、自然转化机制涉及到DNA双螺旋的断裂，并降解其中一条单链，使得另外一条能够进入宿主方法：感受态细胞的转化、原生质体的转化、电穿孔、质粒援救转化目的基因的稳定重组DNA分子通常以CCC的形式存在于质粒中，而后者主要取决于质粒的宿主范围（编码复制过程的蛋白质的数量），如S.aureus 的质粒和RSF1010均可在G+或G-中复制为了扩大宿主范围，通用方法为形成杂交质粒。
如大肠的pBR322和S.aureus或B.subtilis 的pC194、pUB110的混合穿梭质粒。
它的特点，人工构建、两种不同复制起点和选择标记，能在两种类群宿主中存在并复制。
它的优点是大肠能够成为克隆的中间宿主重组DNA的综合重组质粒进入宿主细胞后，通常会有以下结果：1）以稳定的质粒形式存在2）丢失3）通常整合到基因组中4）同源重组：代替经常是双链交换例子：构建了一个集合质粒：neomycin抗性基因和B.subtilis的amyE基因插入到pBR322中，将这个质粒转入B.subtilis，该质粒不能复制，但如果筛选为抗性而做，那么质粒的集合就在amyE处进行。
这一方法可用于构建单拷贝的外源基因的重组子。
G-中的clone经常以大肠作为中间体，因此所需质粒必须能。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证
题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入体现并 PCR 验证。
一．实验目的:1.学习目的基因连接转化载体的原理和办法。
2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和办法。
3.学习菌落 PCR 鉴定阳性克隆的办法和环节二．实验原理1.DNA的连接重组：含有相似粘性末端的两段 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下能够连接在一起。
由于相似的粘性末端同一通过碱基互补配对形成一种相对稳定的构造。
连接温度的选择，理论上的最适温度是连接酶的最适温度---37 摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对构造稳定，因此在室温下（12~16 度）既可最大程度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对构造的稳定。
2.感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预解决的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时 Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶构造，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源 DNA 相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子（如 Mn、C o）、DMSO 或还原剂等物质解决细菌，则可使转化率提高100～1000 倍。
3.质粒的导入在冰上融化感受态细胞，通过 42 度短暂热激后，由于细胞膜处在液晶态产生裂缝，外源DNA 黏附于细胞表面，而后立刻冰浴，促使细胞膜愈合。
然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以增进细胞的愈合恢复。
4.阳性转化的培养基筛选办法。
普通的大肠杆菌难以在含有 Kana 的 LB 培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有 Kana 霉素的抗性基因，因此成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有 Kana 的 LB 培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，因此可能会出现伪阳性，故需要进行 PCR 鉴定。
5.菌落PCR的原理通过目的基因的引物进行菌落 PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过 PCR 获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。
基因的连接实验报告
一、实验目的1. 熟悉基因克隆实验的基本原理和方法；2. 掌握DNA连接技术的操作步骤；3. 学习如何检测连接产物的存在。
二、实验原理基因克隆是将目的基因片段插入到载体DNA中，构建成重组DNA分子，并在宿主细胞中进行复制和表达。
DNA连接技术是基因克隆实验中关键的一步，其原理是利用DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）将目的基因和载体DNA连接起来。
三、实验材料1. 目的基因片段：PCR产物或基因合成片段；2. 载体DNA：质粒或噬菌体；3. DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）；4. 连接缓冲液；5. 琼脂糖凝胶电泳试剂；6. DNA分子量标准；7. DNA纯化试剂盒；8. DNA测序仪；9. 实验器材：PCR仪、离心机、凝胶成像系统、微量移液器、电泳槽等。
四、实验步骤1. 准备反应体系：将目的基因片段和载体DNA分别进行PCR扩增或提取，纯化后按一定比例混合，加入DNA连接酶和连接缓冲液，混匀。
2. 反应条件：将反应体系置于16℃条件下，反应时间为2小时。
3. 反应终止：将反应体系置于70℃水浴中5分钟，使DNA连接酶失活。
4. 琼脂糖凝胶电泳：将连接产物与DNA分子量标准在同一条件下进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接产物是否存在。
5. DNA纯化：将电泳检测到的目的基因片段进行纯化。
6. DNA测序：将纯化后的目的基因片段进行测序，验证连接产物的正确性。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果：若连接产物存在，则在琼脂糖凝胶电泳中可见目的基因片段的条带。
2. DNA测序结果：将测序结果与目的基因序列进行比对，若序列一致，则说明连接成功。
六、实验讨论1. 实验过程中，反应体系的配置要准确，避免因浓度过高或过低导致连接效率降低。
2. DNA连接酶的活性对连接效率有重要影响，选择合适的酶和反应条件可以提高连接效率。
3. 实验过程中，注意防止DNA污染，确保连接产物的纯度。
4. 若连接产物电泳条带不明显，可能是因为连接效率低、DNA浓度低或电泳条件不合适等因素。
分生实验报告 目的基因与载体连接、 感受态制备及转化
目的基因与载体连接、感受态制备及转化【实验原理】1；酶促生物化学反应过程在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。
相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。
2；DNA连接酶的分类：T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子3；T4 DNA连接酶：来源T4噬菌体感染的大肠杆菌最佳pH值7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液需ATP，Mg2+参加反应二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。
4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。
5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统真核细胞：主要用于外源基因的表达6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染：指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
7；感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。
常用方法：0.1mol/L CaCl2特点：a.重组酶缺陷，限制修饰系统缺陷b.不存在载体的筛选标记c.接受DNA的位点暴露d.细胞膜通透性增加8；不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
直接筛选：针对载体携带的标记和插入DNA片段1.抗性筛选（抗生素平板，ampR , tetR , neoR）2.标志补救（α-互补，蓝白斑筛选)3.PCR4.限制性内切酶消化4.DNA测序间接筛选：针对插入片段的蛋白产物，免疫学筛选9；蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
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• 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因 的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物 的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生 物技术的研究中。
• 2.pET28a多克隆位点信息
• Xho I(158) Not I(166) Eag I(166) Hind III(173) Sal I(179) Sac I(190) EcoR I(192) BamH I(198) Nhe I(231) Nde I(238) Nco I(296)
• 3.pet28a抗性是Kana。
连接反应中值得注意的几个问题：
1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可 为8：1到1：16，通常的变化范围是1：3到1：5。插入片段的长度和 序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作 实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积 中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。
本次课程的实验内容：
1. 载体和插入片段DNA的浓度测定 2. 线性化载体和目的基因体外重组 3. 感受态大肠杆菌的制备 4. 重组子的转化 5. 转化大肠杆菌的培养
1.目的基因浓度测定—琼脂糖凝胶电泳法
Total 48,502bp
500 ng
19329/48502*500 ≈ 7743/48502*500 ≈ 6223/48502*500 ≈ 4254/48502*500 ≈ 3472/48502*500 ≈ 2690/48502*500 ≈ 1882/48502*500 ≈ 1489/48502*500 ≈ 925/48502*500 ≈
2.ＤＮＡ分子的体外重组
• ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶 催化两个双链ＤＮＡ片段相邻的５’端磷酸与３’端羟基之 间形成磷酸二酯键的生物化学过程.
ＤＮＡ连接酶
常用的DNA连 接酶有两种： (1)来自大肠 杆菌的DNA连 接酶 (2)来自噬菌 体的T4 DNA连 接酶。
DNA连接示意图
200 ng 80 ng 65 ng 44 ng 36 ng 28 ng 19 ng 15 ng 10 ng
质粒载体特点 1. 至少有一个复制起点， 因而至少可在一种生 物体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位 点，以供外源DNA插 入。 3. 至少应有一个遗传标 记基因，以指示载体 或重组DNA分子是否 进入宿主细胞
质粒载体
• 1.pET-28a(+) sequence landmarks： T7 promoter 370-386 T7 transcription start 369 His•Tag coding sequence 270-287 T7•Tag coding sequence 207-239 Multiple cloning sites (BamH I - Xho I) 158-203 His•Tag coding sequence 140-157 T7 terminator 26-72 lacI coding sequence 773-1852 pBR322 origin 3286 Kan coding sequence 3995-4807 f1 origin 4903-5358
• 4.pET28a启动子是T7，纯化标签是N-His，使用 Ni柱纯化。
• 5.pET28a可以使用的表达菌株有BL21（DE3） 系列的表达菌株，Rosetta和Coden Plus系列菌 株，以及其他可以进行T7启动子表达的菌株都可 以，使用非常广泛也行。
• 6.pET28a蛋白是融合表达蛋白，载体本身就自 带了ATG启动子，只需要将自己的蛋白出入到相 应的多克隆位点处即可进行蛋白表达，但是要注 意插入位点的多克隆位点读码框的正确性，避免 密码子移码突变。
完全失活苯酚处理
连接体系
载体DNA
50 ng ? ul
目的DNA
45 ng ? ul
双蒸水
? ul 17ul
连接反应液（10×）
2 ul
T4连接酶
1 ul
总体积
20ul
用加样器柔和吹打混匀,室温连接6小时。
附注：载体和目的基因的摩尔比为1:5 50ng:5.4kb=9.3ng:1kb 9.3ng*5=46.5ng
2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连
接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温
16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接 酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而 不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。
1. Vector 和insert的连接 --ligation
2 . Construct转入宿主菌 --transform
实验操作（转化）
• 取制备好的感受态细胞，置于冰浴上(50ul)；
• 向感受态细胞中加入5ul连接产物（不超过转化体 系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min；
• 将连接体系放入42℃水浴中热激90sec；迅速转入 冰浴2min；
碱性磷酸酶处理质粒载体
• 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ 的浓度，增加重组子比例。这样就会出现 ＤＮＡ自生连接问题， 为此通常选择对质 粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末 端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形 成的缺口可在转化细胞后得以修复。
载体自连及去磷酸化示意图
常用碱性磷酸酶
BAP（大肠杆菌）
CIAP(小牛肠)
分子量 80,000
分子量 100,000
温度 60 ℃ —65℃
温度 37 ℃
最适PH8.0
最适PH10.0附近（高底物浓度）
热稳定性好，100 ℃暂时性失活， PH 8.0附近（低底物浓度）
室温放置可恢复活性，苯酚完全失 65℃30分钟处理99％的活性不可
活
逆失活，随具体条件改变有变动，