I目的基因与载体的连接
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
载体构建流程
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
挑取阳性克隆去测序
测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的 点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间 的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表 达、结构、功能。 不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修 补。
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
连接
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
基因与载体连接方法
基因与载体连接方法及其原理基因与载体连接方法是分子生物学实验中常用的技术，它可以将目的基因或序列插入到合适的载体中，从而实现基因的克隆、表达或功能分析。
基因与载体连接方法主要依赖于DNA连接酶和限制性核酸内切酶的作用，以及DNA片段末端的互补配对。
根据DNA片段末端的性质不同，可以有以下几种基本的连接方法：一、粘性末端连接法粘性末端连接法是最常用的基因与载体连接方法，它利用限制性核酸内切酶在特定的序列上切割DNA，产生带有单链突出端的双链DNA片段，这些突出端称为粘性末端。
粘性末端可以与相同或相似的粘性末端互补配对，形成稳定的双链结构。
然后，DNA连接酶可以在这些配对的粘性末端上催化磷酸二酯键的形成，从而实现DNA片段的连接。
粘性末端连接法的优点是具有较高的特异性和效率，因为只有相同或相似的粘性末端才能配对，而且配对后的结构较为稳定，不易被水解。
粘性末端连接法的缺点是需要选择合适的限制性核酸内切酶来切割目的基因和载体，而且不同的限制性核酸内切酶可能有不同的反应条件和缓冲液，需要进行优化和调节。
粘性末端连接法的具体步骤如下：1. 选择合适的限制性核酸内切酶来切割目的基因和载体。
一般来说，选择能在目的基因两端和载体多克隆位点上切割出相同或相似粘性末端的限制性核酸内切酶。
如果没有这样的限制性核酸内切酶，可以通过引物设计来在目的基因两端添加所需的限制性核酸内切酶位点，然后通过PCR扩增来获取带有粘性末端的目的基因。
2. 配制酶切反应体系，并在适当的温度和时间下进行反应。
一般来说，每个限制性核酸内切酶都有其特定的反应条件和缓冲液，需要按照说明书或厂家推荐进行操作。
如果使用两种或以上的限制性核酸内切酶进行双酶切或多酶切，需要选择能够同时满足所有限制性核酸内切酶反应条件和缓冲液要求的组合，或者进行分步反应，并在每次反应后纯化DNA。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳来分离和回收目的基因和载体片段。
一般来说，使用1%~2% 的琼脂糖凝胶电泳可以有效地分离不同大小的DNA片段，并通过紫外光照射来观察DNA条带。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
第六章I 目的基因与载体的连接解读
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一 些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到 扩增或正确表达。
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（五）加DNA衔接物连接法
DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡 核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整 末端（与双链目的DNA平端连接），另一 头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的 相应粘端连接）。它在与双链目的DNA连 接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载 体DNA进行连接反应，如图所示。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法： ① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
报告基因
5’
3’
5
二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互相 连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许多 酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于重 组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好 是单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
分子生物学名词解释
三、名词解释基因工程：在体外应用人工方法进行基因重组，然后把重组的基因导入宿主细胞，进行复制、转录及翻译的过程。
PCR技术：针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。
限制性核酸内切酶：识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
基因工程载体：供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或(和)复制的运载工具。
重组DNA技术：重组DNA技术简单概括为：“分、切、接、转、筛”1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体互补DNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成的与mRNA互补的DNA。
四、问答题1、简述基因工程的基本程序。
基本程序目的基因的获得（DNA片段）(分、切）↓DNA片段与载体基因的连接（体外重组）（接）↓连接产物（重组体）导入宿主细胞（转）↓重组体的扩增、筛选与鉴定（筛）↓目的基因在宿主细胞中的表达↓表达产物的分离纯化2、简述基因工程技术在医学上的应用。
（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药（三）基因诊断（四）基因治疗（五）遗传病的预防三、名词解释1、受体：（receptor）细胞膜或细胞内的一些天然分子，能够识别和结合有生物活性的化学信号物质（配体，liganal）,从而启动一系列信号转导，最后产生相应的生物学效应。
2、G蛋白：是一种鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白，一般是指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白。
3、MAPK:MAPK 通路是多种促增殖信号在细胞内信号转导的共同通路。
MAPK 的上游激酶MAPKK 或MEK 是一个DSPK，它能使MAPK 分子中的Thr 185 和Tyr 187 磷酸化而使该酶激活。
4、第二信使：细胞内的化学信号----第二信使5、PTK：酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase, PTK ）是一类能催化蛋白质酪氨酸残基(tyr或Y)磷酸化的蛋白激酶，共同特征是所极端具有典型的PTK结构域，该酶可催化自身或底物磷酸化。
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总结：
同聚物加尾法就是利用末端转移酶 的可催化dNTP加到单链或双链DNA 的３′-OH的能力，在目的DNA和质 粒载体上加入互补同聚物，两者再通 过互补同聚物间的氢键，形成重组子。
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优点：通过DNA加尾，既可以使两个 具平末端的DNA片段进行连接，也可 以使具平末端的DNA片段与粘性末端 的DNA片段进行连接。
多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于
重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件:
1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是
单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA
以最高的几率正确组合.
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① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
5‘
3‘
3‘
5'
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② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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转录
起始 点
插入功能基因
的位点
启动子 操纵子
表达
目的
基因
5’
调控
报告基因
机能
基因
3’
5
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5
二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载
体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互
相连接，形成新的重组分子。
1.对载体的要求：
一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可
与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许
1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。
2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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只要分别获得poly(dA)和poly(dT) 尾巴，就会彼此连接起来。这种连接 DNA分子的方法叫同聚物加尾法。
在特殊反应液(Co2+代替Mg2+)中， 平末端DNA也可以作底物, 而且4种 dNTP中任何一种都可以作反应的前 体，即给平末端DNA 3′-OH的末端， 加上4种同聚物“尾巴”。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末端 也可以采用粘性末端连接.
如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端， 便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的 Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的 Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、 30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应 的配伍末端相互连接。
以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以
期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到
扩增或正确表达。
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2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构
建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启
动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目
的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审
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（三）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具 3′-OH末端的单链片段，也可以是具3'OH突出末端的双链片段。
此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱氧 核苷酸加到单链的3‘-OH基团上，并按 5’→3’方向聚合。
当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的时候， 便能构成由同一种类型核苷酸组成的尾巴， 如poly（dA）等，因此任何两条DNA分 子
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故在平端DNA片段连接工作中，常增加 DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接 的连接酶处理，以期获得比较满意的连接 结果。
有时载体DNA片段是平末端，而目的基因 却是粘性末端，那就需要处理，使载体 DNA和目的基因的末端一致，通常是将目 的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补 法和消除法。
视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白
至关重要。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，
则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。
➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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（二）平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生 DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。
具有平末端的酶切载体只能与平末端的目 的基因连接。
T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制 性内切酶切割的平端间的连接。
平端连接比粘性末端连接要困难的多，其 连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。
第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一
些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基
因．将两者连接起来，将目的基因插入于可
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
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（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子.