目的基因的连接与转化
基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的 DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起 来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时， 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换：
载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片 段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法
1. 同一限制酶切位点连接:
由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子.
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成 的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点，再用限制酶切除产 生粘性 末端，而进行粘端连接。
优点：是进行DNA重组的一种既有效又实用的手 段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优 点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具 有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反 应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端 DNA片段间的连接效率。
不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的 1%。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证
题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入体现并 PCR 验证。
一．实验目的:1.学习目的基因连接转化载体的原理和办法。
2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和办法。
3.学习菌落 PCR 鉴定阳性克隆的办法和环节二．实验原理1.DNA的连接重组：含有相似粘性末端的两段 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下能够连接在一起。
由于相似的粘性末端同一通过碱基互补配对形成一种相对稳定的构造。
连接温度的选择，理论上的最适温度是连接酶的最适温度---37 摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对构造稳定，因此在室温下（12~16 度）既可最大程度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对构造的稳定。
2.感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预解决的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时 Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶构造，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源 DNA 相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子（如 Mn、C o）、DMSO 或还原剂等物质解决细菌，则可使转化率提高100～1000 倍。
3.质粒的导入在冰上融化感受态细胞，通过 42 度短暂热激后，由于细胞膜处在液晶态产生裂缝，外源DNA 黏附于细胞表面，而后立刻冰浴，促使细胞膜愈合。
然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以增进细胞的愈合恢复。
4.阳性转化的培养基筛选办法。
普通的大肠杆菌难以在含有 Kana 的 LB 培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有 Kana 霉素的抗性基因，因此成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有 Kana 的 LB 培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，因此可能会出现伪阳性，故需要进行 PCR 鉴定。
5.菌落PCR的原理通过目的基因的引物进行菌落 PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过 PCR 获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
获取目的基因片段的方法
获取目的基因片段的方法引言在生物研究中，获取目的基因片段是一项重要的任务。
目的基因片段的获取可以用于基因克隆、基因表达、基因测序等多个领域的研究。
本文将介绍几种常用的方法来获取目的基因片段，包括PCR（聚合酶链式反应）、基因片段合成和基因组编辑等方法。
1. PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的方法，通过逐渐扩增目的基因片段。
以下是PCR的步骤：1.设计引物：根据目的基因片段的序列，设计一对引物，分别位于目的基因片段的起始和终止位置。
引物应具有互补性，能够特异性地结合到目的基因片段上。
2.反应体系准备：准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和镁离子等。
根据实验需求，可以添加其他辅助试剂，如引物浓度平衡剂、增强剂等。
3.PCR扩增：将反应体系置于PCR仪中，按照一定的温度程序进行扩增。
PCR的温度程序通常包括变性、退火和延伸阶段。
在变性阶段，DNA双链被变性为单链；在退火阶段，引物与目的基因片段特异性结合；在延伸阶段，聚合酶沿着DNA模板合成新的DNA链。
4.PCR产物检测：扩增反应结束后，可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法检测PCR产物。
琼脂糖凝胶电泳可以根据PCR产物的大小和形状来判断是否成功扩增了目的基因片段。
PCR方法具有简单、快速、灵敏的特点，适用于获取较短的目的基因片段。
2. 基因片段合成基因片段合成是通过化学合成的方法来获取目的基因片段。
以下是基因片段合成的步骤：1.设计目的基因片段：根据研究需求，设计目的基因片段的序列。
可以通过计算机软件进行序列设计，优化序列的GC含量、二级结构和启动子等。
2.合成基因片段：将目的基因片段的序列发送给合成公司，由合成公司进行化学合成。
合成公司通常使用固相合成法合成DNA片段。
合成的基因片段可以经过纯化和修饰等步骤，得到高质量的目的基因片段。
3.克隆基因片段：将合成的基因片段与载体进行连接。
可以使用限制性内切酶切割载体和基因片段的末端，然后通过DNA连接酶将基因片段连接到载体上。
第三篇目的基因的转化
2. Ti质粒的基因位点及其功能区
T-DNA区（transferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌 侵染植物细胞时，从Ti质粒上 切割下来转移到植物细胞的一 段DNA，称为转移DNA。该片 断上的基因与肿瘤形成有关。
Vir区(virulence region)：该区段激活T-DNA的转移，使农杆菌 表现出毒性，故称为毒性区。它与T-DNA区相邻，合起来占质 粒的1/3。
农杆菌质粒第一个字母为小写的p，紧接Ti或At 、Ri或Ar 表示根癌农杆菌质粒或发根农杆菌质粒。后接质粒编号或 分类。
天然质粒符号（ColE1)
pSC101 SC表示Stanley Cohen，101表示分类号 pMT555 MT表示Manchester Technology 555表示分类号
Mini Ti plasmid Helper Ti plasmid
载体卡盒（vector cassette
第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构 和功能
一、根癌农杆菌
Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease of a wide range of dicotyledonous (broadleaved) plants, especially members of the rose family such as apple, pear, peach, cherry, almond, raspberry and roses. A separate strain, termed biovar 3vine.
第五节ri质粒载体系统发根发根hairyroothairyroot是发根农杆菌是发根农杆菌agrobacteriumrhizogenesagrobacteriumrhizogenes感染整体植株感染整体植株或其某一器官组织单个细胞甚至原生或其某一器官组织单个细胞甚至原生质体后其质体后其riri质粒上的质粒上的ttdnadna片断整合片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型形成多分枝的生长迅速的不殊表现型形成多分枝的生长迅速的不在ri质粒tdna区段中除了含有色氨酸2单加氧酶基因iaam和吲哚乙酰胺水解酶基因iaah之外还有4个叫做根座位rootlocus的基因rol
基因与载体连接方法
基因与载体连接方法及其原理基因与载体连接方法是分子生物学实验中常用的技术，它可以将目的基因或序列插入到合适的载体中，从而实现基因的克隆、表达或功能分析。
基因与载体连接方法主要依赖于DNA连接酶和限制性核酸内切酶的作用，以及DNA片段末端的互补配对。
根据DNA片段末端的性质不同，可以有以下几种基本的连接方法：一、粘性末端连接法粘性末端连接法是最常用的基因与载体连接方法，它利用限制性核酸内切酶在特定的序列上切割DNA，产生带有单链突出端的双链DNA片段，这些突出端称为粘性末端。
粘性末端可以与相同或相似的粘性末端互补配对，形成稳定的双链结构。
然后，DNA连接酶可以在这些配对的粘性末端上催化磷酸二酯键的形成，从而实现DNA片段的连接。
粘性末端连接法的优点是具有较高的特异性和效率，因为只有相同或相似的粘性末端才能配对，而且配对后的结构较为稳定，不易被水解。
粘性末端连接法的缺点是需要选择合适的限制性核酸内切酶来切割目的基因和载体，而且不同的限制性核酸内切酶可能有不同的反应条件和缓冲液，需要进行优化和调节。
粘性末端连接法的具体步骤如下：1. 选择合适的限制性核酸内切酶来切割目的基因和载体。
一般来说，选择能在目的基因两端和载体多克隆位点上切割出相同或相似粘性末端的限制性核酸内切酶。
如果没有这样的限制性核酸内切酶，可以通过引物设计来在目的基因两端添加所需的限制性核酸内切酶位点，然后通过PCR扩增来获取带有粘性末端的目的基因。
2. 配制酶切反应体系，并在适当的温度和时间下进行反应。
一般来说，每个限制性核酸内切酶都有其特定的反应条件和缓冲液，需要按照说明书或厂家推荐进行操作。
如果使用两种或以上的限制性核酸内切酶进行双酶切或多酶切，需要选择能够同时满足所有限制性核酸内切酶反应条件和缓冲液要求的组合，或者进行分步反应，并在每次反应后纯化DNA。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳来分离和回收目的基因和载体片段。
一般来说，使用1%~2% 的琼脂糖凝胶电泳可以有效地分离不同大小的DNA片段，并通过紫外光照射来观察DNA条带。
转化连接实验报告
一、实验目的1. 了解转化连接的原理和过程；2. 掌握转化连接的操作步骤；3. 学习检测转化连接结果的方法。
二、实验原理转化连接是指将目的基因与载体连接，并将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因的过程。
转化连接包括DNA连接和转化两个步骤。
1. DNA连接：利用DNA连接酶将目的基因与载体连接，形成重组质粒。
DNA连接酶能够催化两个DNA分子的末端以磷酸二酯键相连，形成完整的DNA分子。
2. 转化：将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因。
转化方法有多种，如电转化、化学转化等。
三、实验材料1. 试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、dNTPs、DNA分子量标准、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳试剂等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计、离心机、移液器等；3. 培养基：LB培养基、氨苄西林等。
四、实验步骤1. 目的基因和载体的制备：利用限制性内切酶分别切割目的基因和载体，获得具有相同黏性末端的DNA片段。
2. DNA连接：将目的基因和载体片段按照一定比例混合，加入DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和dNTPs，在适当的温度下进行连接反应。
3. 重组质粒的制备：将连接反应产物进行PCR扩增，获得目的基因和载体的重组质粒。
4. 重组质粒的鉴定：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察重组质粒的分子量是否与预期相符。
5. 转化：将重组质粒转化至受体细胞中，如大肠杆菌。
常用的转化方法有电转化、化学转化等。
6. 转化细胞的培养：将转化后的细胞在含有氨苄西林的LB培养基中培养，以便筛选含有重组质粒的转化细胞。
7. 阳性克隆的筛选：通过PCR或DNA测序等方法，检测转化细胞中是否含有目的基因，筛选出阳性克隆。
五、实验结果与分析1. 重组质粒的制备：通过PCR扩增获得重组质粒，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR 产物与预期分子量相符。
2. 转化细胞培养：在含有氨苄西林的LB培养基中培养转化细胞，观察细胞生长情况。
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17 ng 50 ng 1.2 ul
附注：目的DNA的总体积是3ul，如果不够总
质量以总体积为准
1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可 为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度 和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要 作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体 积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。
分子量 100,000
温度 37 ℃
最适PH10.0附近（高底 物浓度）PH 8.0附近（低底
物浓度）
65℃30分钟处理 的活性不可逆失活，随 具体条件改变有变动， 完全失活苯酚处理
本实验连接材料及连接 体系
连接示意图
连接体系
载体DNA 目的DNA 连接缓冲液（5×）
用蒸馏水稀释至6ul
感受态细胞的制备
Hanahan法是制备高效感受态细菌的标准方法。
这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到 109 cfu/µg DNA。
注：1.低温培养，18℃培养至OD600约为0.5； 2.超净台无菌操作，低温操作； 3.标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不同， 不同质粒形态转化率也不相同。
目的基因的 连接、转化
分类及原理
分类：
根据限制性内切酶酶切后产生的末端 的类型，分为非互补突出末端的连接、相 同粘性末端的连接、平末端连接
DNA连接示意图
载体自连及去磷酸化
常用碱性磷酸酶
BAP（大肠杆菌）
CIAP(小牛肠)
分子量 80,000
温度 60 ℃ —65℃
最适PH8.0
热稳定性好，100 ℃暂 时性失活，室温放置可 恢复活性，苯酚完全失 活
转化原理
1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶 结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成 了大肠杆菌人工诱导的感受态；
2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷 酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；
转化示意图
连接效率的计算
连接效率=
转化子数 载体质量
×转化效率×100%
(个/ ng)
(个/ ng)
3. 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之 出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的 存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌 株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。二甲基亚砜（DMSO）和二巯 基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，大大提高了大 肠杆菌的转化效率。
2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连
接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温
16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接 酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。
3. 载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而 不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。