基因表达沉默技术
RNA介导的基因沉默技术研究
RNA介导的基因沉默技术研究基因沉默是基因表达调控的一种机制，它通过阻断基因转录或抑制已经转录的mRNA的翻译来抑制基因表达。
RNA介导的基因沉默技术采用了RNA作为调控基因表达的工具。
这种技术广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农作物改良等领域。
RNA介导基因沉默技术主要分为siRNA、miRNA和shRNA三类。
1. siRNAsiRNA是20-25个核苷酸的双链RNA，它通过与靶基因mRNA特异性杂交，介导RNA诱导靶基因沉默。
这个过程通过小核RNA和RISC( RNA-Induced Silencing Complex)协同完成。
当siRNA与mRNA杂交后，RISC会切断mRNA形成不完整的片段，导致mRNA降解或翻译抑制。
siRNA技术可以实现精准靶向，对于多种疾病治疗具有潜在的应用价值。
但是，siRNA技术的缺点是需要选择合适的RNA靶点，并且siRNA的短寿命和难以穿透细胞膜限制了其广泛应用。
2. miRNAmiRNA是20-24个核苷酸的单链RNA，它通过特异性结合目标mRNA，同时与RISC结合，引导RISC切割目标mRNA分子。
同时，miRNA还可以通过直接结合靶标的5’端和3’端调控mRNA 的效率和速度。
miRNA广泛参与基因表达调控，可以调控20000多种基因的表达。
miRNA的缺点是具有很高的复杂性和不确定性。
miRNA靶基因的预测算法准确性存在差异，miRNA同靶基因的作用机制还需要进一步研究。
3. shRNAshRNA是基于RNA干扰技术的新型分子，可以在基因水平靶向RNA，抑制基因表达。
shRNA是单链RNA，具有RNAi引发靶基因沉默的功能。
其优点是技术简单，稳定性较好，可以长期干扰一个基因，生成稳定的RNAi信号。
但是，shRNA技术的缺点是仍然存在一些安全性问题和非特异性靶向的可能性。
实现精准稳定靶向仍然是一个需要解决的问题。
RNA介导的基因沉默技术具有广泛的研究和应用前景。
编辑性基因沉默技术的应用
编辑性基因沉默技术的应用编集性基因沉默技术的应用随着基因科学的发展，编辑性基因沉默技术在生物医学领域中得到越来越广泛的应用，为我们开启了新的治疗方法。
那么，到底什么是编辑性基因沉默技术？它有哪些应用？本文将详细介绍。
一、编辑性基因沉默技术是什么编辑性基因沉默技术是一种通过修改基因表达，来达到治疗某些疾病的方法。
它的核心思想是通过编写一段能够识别某个基因序列的RNA，将其引导到该基因的位置，并引发基因的自我沉默（即禁止基因表达），从而达到治疗目的。
它可以在胚胎或者已经出生的个体中实现。
在具体的实践中，科学家们借鉴了CRISPR-Cas9技术的原理，对具体的基因序列进行精确的识别和修改。
二、编辑性基因沉默技术的应用编辑性基因沉默技术的应用非常广泛，下文将就几个比较典型的案例进行阐述。
1. 治疗疾病编辑性基因沉默技术可以用来治疗一些疾病，如癌症、血液病和肌少症等等。
以癌症为例，科学家们利用该技术将一些蛋白质基因的表达禁止，从而达到控制肿瘤生长的目的。
此外，该技术还可以用来治疗一些人类遗传疾病，例如先天性免疫缺陷病和红斑性狼疮等。
2. 动物基因编辑编辑性基因沉默技术还可以用来编辑动物的基因，从而实现一些有趣的目的。
例如，科学家们可以编辑虫子的基因，使其变成基因描述马的耳朵或者猫眼睛的虫子，或者使其变成闪耀的荧光虫子，为科学家们的研究提供有效的工具。
3. 基因性别鉴定编辑性基因沉默技术还可以用来实现基因性别鉴定。
在人类的基因中，男性和女性都有一条性染色体，分别是XY和XX。
科学家可以通过沉默其中一个性染色体上的基因来推断出该个体的基因性别。
这对于一些疾病的研究和治疗都非常有价值。
三、编辑性基因沉默技术的优势相较于其他基因编辑技术，编辑性基因沉默技术有以下几个优势：1. 准确性高编辑性基因沉默技术可以精确地识别基因序列，从而对其进行修改，并禁止其表达。
这种修改的准确性非常高，因此可以有效地控制治疗效果，不会引发额外的不良反应。
基因沉默的原理及其应用
基因沉默的原理及其应用1. 基因沉默概述基因沉默是指通过特定的机制，使得基因表达降低或完全抑制的现象。
它是维持细胞内基因表达稳定性的重要机制之一。
基因沉默的方式主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰等。
基因沉默在生物学研究、基因治疗以及农业生产等方面具有广泛的应用前景。
2. 基因沉默的原理2.1 DNA甲基化DNA甲基化是一种通过在DNA分子上添加甲基基团来改变基因表达的方式。
在DNA甲基化过程中，甲基转移酶将甲基基团转移到DNA分子上，从而使得DNA的结构发生改变，导致基因的表达发生变化。
DNA甲基化通常会导致基因的沉默，而去甲基化则可以解除基因的沉默。
2.2 组蛋白修饰组蛋白修饰是一种通过改变染色质的结构和构象来调控基因表达的方式。
组蛋白是染色质的主要组成部分之一，它可以通过添加或去除特定的化学修饰基团来改变染色质的结构。
这些修饰可以影响DNA与组蛋白之间的相互作用，从而影响基因的转录和表达水平。
2.3 RNA干扰RNA干扰是一种通过引入外源性的RNA分子来抑制特定基因表达的方式。
在RNA干扰过程中，外源性的RNA分子与目标基因的mRNA序列互补配对，形成RNA复合体，并通过RNA酶的作用将目标基因的mRNA降解或抑制其翻译过程。
这种方式可以有效地沉默目标基因，从而改变基因表达的水平。
3. 基因沉默的应用3.1 基因功能研究基因沉默技术为研究基因的功能提供了重要的工具。
通过使用RNA干扰技术，可以特异性地沉默目标基因，然后观察沉默后的细胞或生物体的表型变化，从而揭示该基因在生物体中的功能和作用机制。
3.2 基因治疗基因沉默技术在基因治疗方面具有潜在的应用价值。
通过选择性地沉默致病基因，可以抑制其表达，从而达到治疗疾病的目的。
例如，通过沉默癌细胞的关键基因，可以达到抑制肿瘤生长的效果。
3.3 农业生产基因沉默技术在农业生产中也有广泛的应用前景。
通过沉默特定基因，可以改变农作物的性状，使其具有更好的抗病性、耐逆性以及产量的提高。
基因沉默的技巧
基因沉默的技巧基因沉默是一种控制基因表达的方法，通过阻断特定基因的转录或翻译过程来抑制基因的功能。
这项技术可以帮助我们研究基因的功能以及疾病的发生机制，并且可以在基因治疗和生物工程中应用。
基因沉默的技巧主要有两种：RNA干扰（RNA interference，RNAi）和CRISPR/Cas9。
下面将详细介绍这两种技术及其应用。
1. RNA干扰（RNAi）：RNA干扰是一种通过RNA分子的相互作用来抑制特定基因表达的技术。
它利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或microRNA（miRNA）与靶基因的mRNA结合，形成双链RNA复合体，在细胞内启动RNA降解机制，降解靶基因的mRNA，从而阻断靶基因的转录和翻译。
在实验室中，研究者可以合成特定靶向基因的siRNA或miRNA，并将其转染入细胞中。
为了提高转染效率，研究者通常会使用载体或转染试剂，帮助siRNA 或miRNA进入细胞内。
RNA干扰技术的优点是简便易行、基因特异性高，可以在多种细胞类型中应用，而不仅限于哺乳动物细胞。
在生物医学研究中，RNA干扰技术被广泛应用于基因功能研究、基因治疗、疾病模型的建立等方面。
通过沉默特定基因，研究者可以研究该基因的功能以及与其相关的信号通路；通过沉默病理基因，研究者可以评估基因治疗的潜力，并寻找治疗疾病的新靶点。
2. CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9是一种基因组编辑技术，也可以用于基因沉默。
它利用Cas9蛋白与特定的导向RNA（gRNA）形成复合物，通过与靶基因的DNA序列互补配对，引导Cas9蛋白在特定位点上切割DNA，导致DNA双链断裂。
然后细胞内的修复机制会修复该断裂，并可能导致基因沉默。
CRISPR/Cas9技术的优点是高效、精准、灵活，并且可以在多种生物体内应用。
研究者可以设计特定的gRNA，使其与靶基因的DNA序列完全互补配对，从而实现对该靶基因的沉默。
RNA介导基因沉默及其在基因表达调控中的作用研究
RNA介导基因沉默及其在基因表达调控中的作用研究基因表达调控是生物体内许多生物过程的调控基础，包含基因激活与沉默两个方面。
对于人们如何理解和掌握基因表达调控过程，RNA介导的基因沉默技术为人们提供了很好的契机。
RNA介导基因沉默是通过RNA干扰技术以实现基因的靶向沉默，这个方法基本上已经成为了一个点对点的路径。
这个方法不仅对研究复杂生物生理学以及疾病具有重要的应用价值，并且已经被广泛地应用于研究复杂生物学进程的调节机制。
RNA介导基因沉默技术简介RNA介导基因沉默技术是通过RNA干扰技术以实现基因的精准靶向沉默的。
RNA干扰分别有siRNA和miRNA两种基本类型，其中siRNA是经过高浓度体外合成的双链RNA，与mRNA的序列完全相反，可以通过介导agoshRNA-DICER 复合物来形成出局的mRNA，达到干扰mRNA基因沉默的目的； miRNA的干扰作用主要是介导RISC复合物作用于靶向RNA的剪切降解或者是翻译抑制。
RNA介导基因沉默技术的应用价值RNA介导基因沉默技术不仅仅被应用到了许多基础研究领域，同时也已经在生物医学研究领域中展现出了其广泛的应用价值。
1. 用于高通量筛选药物靶点RNA干扰技术在高通量筛选药物靶点这一研究领域具有越来越重要的作用。
在新药开发当中，高通量药物靶点筛选技术被广泛应用，而RNA介导基因沉默技术又成为了其中一项重要的技术手段之一。
通过基因沉默技术，可以快速筛选出足够的生物靶点来发现新型高效的药物。
2. 用于全基因组表达谱的分析以及生物进化的研究RNA介导基因沉默技术不仅可以通过基因沉默方法来分析全基因表达谱以及生物进化过程中的一些重要生物学问题，还可以通过细胞模型来研究分子调节过程并有效评估控制调节的结果。
大量的一些研究表明，RNA介导技术已经证实了在基因表达控制和剪接控制中具有重要的作用。
3. 用于疾病的诊断和治疗RNA介导技术在肿瘤治疗和病毒感染相关研究中的应用较为成熟完善，如用RNA介导技术来靶向肿瘤细胞上的抗癌基因，从而发挥肿瘤治疗的作用；同时用RNA介导技术来阻断病毒的繁殖过程，从而达到病毒感染治疗效果。
基因沉默的原理及应用
基因沉默的原理及应用一、基因沉默的原理基因沉默是指通过RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术，特异性地抑制特定基因的表达。
基因沉默在生物学研究中具有重要的应用价值，其原理主要包括以下几个方面：1. siRNA的合成与靶向短干扰RNA（short interfering RNA，简称siRNA）是基因沉默的关键分子。
在细胞内，siRNA会与RNA诱导靶向耗竭（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，形成RNA-蛋白复合体，然后通过匹配特定序列，将复合体定位到目标mRNA上，最终导致mRNA降解、剪接或抑制翻译。
2. miRNA的生成和功能微小RNA（microRNA，简称miRNA）是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码RNA分子。
miRNA产生于细胞内，通过与RNA诱导靶向耗竭结合，实现对mRNA的调控。
miRNA主要通过与mRNA的3’非翻译区域互补配对，诱导mRNA的降解或抑制翻译，从而实现目标基因的沉默。
3. RISC的功能和调控RISC是RNA干扰过程中的一个重要复合体，其主要成员包括siRNA或miRNA，以及相关的蛋白质。
RISC在基因沉默中起到关键的作用，通过与靶向RNA结合，实现对mRNA的调控。
RISC中的蛋白质能够辅助siRNA或miRNA与靶向RNA的杂交，并促进靶向RNA的降解或抑制翻译。
二、基因沉默的应用基因沉默技术已经在许多领域展现出广阔的应用前景，一些典型的应用包括：1. 研究基因功能基因沉默可以通过抑制特定基因的表达，来研究该基因在生物体中的功能。
通过沉默特定基因后，研究人员可以观察到沉默基因对生物体的影响，从而揭示出特定基因在生物体发育、代谢、免疫等方面的作用，为相关研究提供有力的证据。
2. 治疗基因相关疾病基因沉默技术在治疗基因相关疾病方面具有巨大的潜力。
通过针对病因基因进行沉默，可以有效地抑制病因表达，从而达到治疗目的。
RNAi技术
RNAi技术1. 引言RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术是一种基因沉默技术，通过利用小分子RNA分子调节基因的表达，从而实现对目标基因沉默的目的。
RNAi技术的出现，彻底改变了分子生物学的研究方法，为研究基因功能以及治疗基因疾病提供了新的手段和途径。
2. RNAi技术的原理RNAi技术基于RNA干扰生物过程中产生的一种自我保护机制，即小分子RNA分子干扰RNA的翻译过程。
在这个过程中，RNAi分子通过与RNA互补配对，形成RNA-RNA复合物，这种复合物在RNA酶的作用下被剪切成更小的RNA分子。
这些小RNA分子可以继续识别新的RNA，并在细胞中导致基因沉默（图1）。
图1 RNAi技术的原理示意图3. RNAi技术的应用3.1 RNAi技术在基因功能研究中的应用RNAi技术被广泛应用于分子生物学和细胞生物学的研究中。
通过设计和构建与目标RNA互补的RNAi分子，可以实现对该基因的瞬时或持续沉默。
这种方法可以用来研究基因在生物学过程中的功能以及相互作用，同时也可以用来筛选或验证药物靶标。
3.2 RNAi技术在疾病治疗中的应用由于RNAi技术可以实现对单一基因的沉默，因此它成为治疗基因疾病的一种有效手段。
通过将RNAi分子直接引入到体内，可以实现对特定疾病相关基因的沉默，从而治疗疾病（图2）。
图2 RNAi技术在疾病治疗中的应用示意图4. RNAi技术的优缺点4.1 优点（1）靶向性好：RNAi技术可以实现对特定基因的沉默，从而精确地调控基因表达。
（2）效率高：RNAi技术可以快速地实现基因沉默，因此在基因研究和药物研发中得到了广泛应用。
（3）安全性高：RNAi技术只对特定基因的表达产生影响，不会对细胞或机体整体产生不利影响。
4.2 缺点（1）技术复杂：RNAi技术需要专业知识和技术，因此需要专业技术人员操作。
（2）RNAi分子稳定性低：RNAi分子容易被降解，因此在RNAi技术的应用中需要结合载体和转染技术来增加RNAi分子的稳定性和转染效率。
RNA干扰技术的应用及其局限性
RNA干扰技术的应用及其局限性RNA干扰技术，简称RNAi技术，是一种基因沉默技术，可用于调控、研究基因表达，也被广泛应用于治疗基因疾病、抗癌等领域。
然而，RNAi技术也有其局限性，在应用过程中需要注意一些问题。
一、RNA干扰技术的应用1. 遗传功能研究：利用RNAi技术将特定基因的表达沉默，可以诱导基因敲除或部分失活，进而研究基因在生理生化过程中的作用。
2. 生物制药： RNAi技术被用于制备某些生物制剂，如抗癌药物和疫苗，以便更好地从疾病中恢复健康。
3. 治疗基因疾病： RNAi技术可以用于治疗基因疾病，例如肝胆疾病、糖尿病等。
它可以靶向特定的基因序列，然后暂时沉默目标基因，以达到缓解症状的效果。
4. 抗癌： RNAi技术被广泛用于抗癌领域。
它可以靶向肿瘤相关基因，抑制肿瘤细胞的增殖和扩散，从而达到治疗癌症的目的。
二、RNA干扰技术的局限性1. 不稳定性：RNAi技术的转染效果通常持续不久，因为RNAi只通过RNA干扰来降低特定基因的表达，而RNA的稳定性差，容易被酶降解，失去干扰作用。
2. 靶向效率低：RNAi技术需要非常精准的靶向，如果靶向错误，甚至可能有副作用。
然而，由于RNA序列相同或相似的基因广泛存在，靶向效率很低，而且RNAi技术只能消耗，无法低效的基因也可能因RNAi技术而被降低表达。
3. 难以转染： RNAi技术需要将RNA分子引入靶细胞内，但转染效率甚至低至1%-5%，特别是对于成体细胞。
因此，使用这种技术的疗法无法达到理想的治疗效果。
4. 免疫反应：RNAi技术还可能会诱导系统性的免疫反应，这可能会影响RNAi技术的应用，不能长时间使用。
三、掌握RNA干扰技术的注意事项1. 选择合适的靶向序列：选择合适的靶向序列是RNAi技术成功的关键。
靶向序列需要选择独特的、在细胞内广泛表达的基因，以提高干扰效率和减轻副作用。
2. 选择合适的信噪比检测方法：使用RNA干扰技术需要较死的检测方法来检测靶基因的表达或沉默，以监测RNAi技术的有效性和是否产生异常细胞反应。
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基本概念
• 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序 列，包括反义DNA和反义RNA。
反义DNA 技术
反义RNA 技术
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反义抑制的主要机理
直接作用于靶 mRNA的SD序列或部分编码区，直 接抑制翻译，或与靶 mRNA结合形成双链 RNA， 从而易被RNA酶H降解。 mRNA 反义 核酸
40
Tysabri
2004 专治多发性硬化症
41
42
第三节 核酶技术
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基本概念
核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的 RNA ，化学本质是 RNA, 却 具有酶的催化功能。
44
历史由来
1982
切赫(T.R.Cech)（1947-），美国人, 他独立地发现发现四膜虫转录 产物rRNA前体，可切除自身的 413个核苷酸的内含子，使两个 外显子拼接起来，变成成熟的 rRNA分子。
取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞
能在体外培养，保留发育的全能性 1981 年 ， 马 丁 · 埃 文 斯 (Martin J ． Evans) 从正常的小鼠囊胚中 分离到了ES细胞。小鼠ES细胞的 分离和应用是ES细胞技术发展的 里程碑。
52
b. 同源重组技术应用
同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中 相同或者相似DNA序列间的重组，通常通过一对同源分 子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。
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第二代修饰(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)
Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways 38
Macugen 哌加他尼
2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症
39
Fuzeon
2003 新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物
siRNA 在 ATP 参 与 下 形 成RISC复合体，被RNA 解旋酶解旋成单链，并 由其中的反义链指导移 至 靶 mRNA ， 靶 mRNA 被切割后诱发宿主细胞 针 对 这 些 mRNA 的 降 解 反应。 10
重点
靶
siRNA siRNA实验设计
19 bp duplex
难点
21 nt
2 nt 3 overhangs
隆富集的倍数高 3~10 倍，真正使 得同源重组技术得以应用。
丙氧鸟苷
马里奥· 卡佩基安德(Mario R．Capechiand)
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Oliver Smithies 奥利弗· 史密斯
Martin Evans 马丁· 埃文斯
Mario Capecchi 马里奥· 卡佩基
56
原理和操作流程
57
58
11
’
1）靶序列的调出
National Center for Biotechnology Information
12
13
14
2）利用免费设计软件进行siRNA设计
Invitrogen
Takara Oligoegine
15
软件的选择原则
1 、选择可读框内、翻译起始位点之后 50 ～100nt 的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；
RNase H
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反义核酸应用
论著超过１６０００篇。
•基因功能研究（ 1994年流行）
•如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。
34
1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正 式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 “Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国 上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用 于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨 细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物 （利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应 有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质 激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了
反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的 复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核 酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific
3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；
4、碱基数目控制在19～21nt；
5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。
16
6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；
我用的软件：siDirect
17
3）siRNA合成或表达
RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：
53
1985年，奥利弗· 史密塞斯(Oliver Smithies) 等首次报道在肿瘤细胞 中实现了人工打靶载体和内源 β球蛋白基因间的同源重组。
54
1988 年，卡佩基安德等发展了一
种称为“正负筛选”的策略，将
胸腺嘧啶激酶基因（ tk ）置于打 靶载体的外侧，作为筛选的负性
标记。这比单用阳性筛选正确克
5
发现历史
1995年． ． ． ． ． ．
antisense sense
注射
注射
秀丽线虫
6
． ． ． ． ． ． 1998年
反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；
而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的
表达。
7
2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine
基因表达沉默技术
药学系药物基因组学教研室
2010.06.18
1
教学内容及要求
1 2
RNA干扰 技术 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术
重点
3
4
熟悉
2
参考资料
《基因工程及其分子生物学基础-基因 工程分册》，北京大学出版社，静国 忠编 自备材料（个人实践经验）
3
第一节 RNA干扰技术
4
基本概念
掌握
RNA 干 扰 (RNA interference, RNAi): 由 小双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降 解的现象。
小 干 扰 RNA: 具 有 干 扰 功 能 的 这 种短双 链 RNA 就称为小干扰 RNA （ Small interfering RNA,siRNA)。
感想 1.意外=Key 2.科研选题：follow or create? 3.Pure scientist
60
作业
1. 简述RNAi实验设计流程
2. 简述马里奥· 卡佩基安德(Mario R．Capechiand)的“正负筛选”的策略
61
62
2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇
35
技术难点
提高有效性
a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力
H
deoxyribose
36
第一代硫代修饰（Phosphorothioate）
O
Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways
Andrew Z. Fire 安德鲁· 菲尔
Craig C. Mello 克雷格· 梅洛
8
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现 RNAi 也存在于水稻、烟草、果 蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。
9
RNAi 机制
外 源 长 dsRNA 在 ATP 作 用下被RNaseⅢ Dicer切 割成 21nt 左右 、 由 正义 和反义链组成的siRNA
Protein: Western blot
17siRNA
Mock
24
5)合成or构建载体？
A. 化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭 菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。
B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达 siRNA。
小结
1、RNAi技术： 基本概念； RNAi技术发展历史； RNAi机制； RNAi设计。 2、反义核酸技术： 基本概念； 技术应用。 3、核酶技术： 核酶概念； 核酶发展历史； 核酶技术应用。 4、基因敲除技术： 基因敲除技术的概念； 基因敲除技术的发展历史； 基因敲除技术的建立及技术流程。
59
C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞 用逆转录载体或慢病毒载体。
25
6）体外导入细胞
a.脂质体转染：
＋＋ ＋ ＋ ＋
－ － － － － ＋ －
具体操作步骤： 按照脂质体说明书进行
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b.电穿孔导入：
27
c.病毒感染（以腺病毒为例）：
28
29
第二节 反义核酸技术
30
历史由来
转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。
18
19
20
21
3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl 90°C 4 min 70°C 10 min 室温
22
4) siRNA working?
23
mRNA:Real-time PCR