人工微RNA定向基因沉默
rnai技术原理
rnai技术原理RNAi技术原理。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种特殊的基因沉默技术，通过特异性降解靶基因的mRNA，从而抑制靶基因的表达。
RNAi技术被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农业生物技术等领域。
本文将介绍RNAi技术的原理及其在生物学研究中的应用。
RNAi技术的原理主要包括三个步骤，siRNA合成、RNA诱导靶基因沉默和RNA诱导沉默的效应。
首先，siRNA由外源DNA转录而来，或由细胞内Dicer酶切割长双链RNA产生。
siRNA由RISC复合物识别并结合，导致RISC复合物介导的靶基因mRNA降解。
最终，靶基因的表达被抑制，从而实现基因沉默的效果。
RNAi技术在基因功能研究中有着广泛的应用。
通过合成siRNA，研究人员可以选择性地沉默感兴趣的基因，从而研究其功能。
利用RNAi技术，研究人员可以验证基因的功能、探索信号通路、筛选药物靶点等。
此外，RNAi技术还被应用于疾病治疗领域。
通过设计siRNA靶向疾病相关基因的mRNA，可以实现对疾病基因的特异性沉默，为基因治疗提供了新的途径。
除此之外，RNAi技术还在农业生物技术领域发挥着重要作用。
利用RNAi技术，可以设计siRNA靶向害虫或病原体的基因，从而实现对害虫或病原体的生物防治。
此外，RNAi技术还可以用于改良作物品质、提高作物产量等方面。
综上所述，RNAi技术作为一种重要的基因沉默技术，具有广泛的应用前景。
通过深入理解RNAi技术的原理，研究人员可以更好地利用这一技术，推动基因功能研究、疾病治疗和农业生物技术等领域的发展。
RNAi技术的不断创新和应用将为生命科学领域带来更多的突破和进展。
基因沉默的研究及应用实例简介
RNAi研究的一般技术路线
siRNA 的设计
• siRNA（small interfering RNAs，siRNAs） 即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并 将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则：
（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并 记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更 为有效。 （ 2 ）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除 那些和其他编码序列同源的序列。 （ 3 ）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设 计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
转染细胞
• 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达 框架转导至真核细胞中的方法主要有以下 几种： • 1.磷酸钙共沉淀 • 2.电穿孔法 • 3. DEAE-葡聚糖和polybrene • 4.机械法 • 5.阳离子脂质体试剂
为了达到高的转染效率，在转染实验过程 中，需要注意以下几点：
• 1.纯化siRNA • 2.避免RNA酶污染 • 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转 染的重复性 • 4.避免使用抗生素
RNAi 的 原 理
RNAi的基本过程
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA， 消耗能量； RISC（RNA-induced silencing complex）形 成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、 RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能 量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的 复合体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下， RISC识别并切割互补的靶RNA。
rnai的原理
rnai的原理RNAi的原理。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由外源双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的现象，是一种高度保守的生物现象，存在于真核生物的细胞中。
RNAi技术被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农业生产等领域。
本文将介绍RNAi的原理及其在基因沉默中的作用机制。
RNAi的原理主要包括三个步骤，RNA干扰诱导、RNA干扰信号放大和RNA 干扰效应。
首先，外源dsRNA或内源miRNA被切割成21-23个碱基的小RNA片段，这些小RNA片段与RNA诱导靶向基因沉默的复合物结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。
RISC可将小RNA片段的信息传递到靶标mRNA上，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而实现基因的沉默。
RNAi在基因沉默中的作用机制主要涉及到两种小RNA，siRNA和miRNA。
siRNA是由外源dsRNA切割产生的，可以完全匹配靶标mRNA序列，导致mRNA 的降解；miRNA则是由内源基因产生，与靶标mRNA序列部分匹配，主要导致翻译抑制。
siRNA和miRNA都能通过RISC介导的方式实现基因的沉默，从而调控细胞的生理过程。
RNAi技术在基因功能研究中有着重要的应用。
通过合成siRNA或miRNA，可以特异性地沉默目标基因，从而研究其在细胞信号传导、代谢途径、细胞周期等生物学过程中的作用。
此外，RNAi技术还可以应用于疾病治疗，例如利用siRNA 沉默病毒基因或致病基因，治疗病毒感染或遗传疾病。
在农业生产中，RNAi技术也可以用于抗虫、抗病和改良作物品质等方面。
总之，RNAi作为一种高效、特异性的基因沉默技术，已经成为生命科学研究和生物技术应用中的重要工具。
通过深入理解RNAi的原理和作用机制，我们可以更好地利用这一技术，推动基因功能研究、疾病治疗和农业生产的发展。
RNA干扰技术的分子生物学机制
RNA干扰机制的破解
掌握RNA干扰技术的分子生物学机制是了解RNA干扰的关键。研究表明，RNA干扰技术的分子生物学机制主要分为三个方面：1）siRNA和miRNA的合成；2）RISC组装和mRNA选择；3）靶基因mRNA的降解和抑制。
siRNA和miRNA的合成
siRNA和miRNA的合成过程类似，包括以下步骤。首先，dsRNA或pre-miRNA经过Dicer酶介导的切割产生20-25个核苷酸的siRNA或miRNA。然后，这些小RNA分子成为RISC的重要组成部分。最后，小RNA将以亚细胞定位方式与RISC的分子组分Ago和其他蛋白质相结合，从而具有生物学活性。
RNA干扰技术的分子生物学机制
RNA干扰技术是一种利用小分子RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA）介导的基因沉默，从而抑制特定蛋白质表达的技术。这一技术在分子生物学和生物医学领域中被广泛应用，尤其是在RNAi药物的开发、基因功能研究和病毒防治等方面。本文将探讨RNA干扰技术的分子生物学机制。
siRNA和shRNA：通过基因沉默抑制蛋白表达的工具
siRNA和shRNA：通过基因沉默抑制蛋白表达的工具RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。
RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。
沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。
这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。
通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。
这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。
[放大]图1.siRNA和shRNA结构。
（A）siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。
（B）shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。
（C） shRNA构建用于插入表达载体。
源自 [1, 2] 。
背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。
1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。
然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。
最终确定小RNA 途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA 干扰途径一样。
表一总结了RNA 干扰机制的主要元件。
它们包括锁定靶基因的双链RNA （siRNA 或shRNA ）、Dicer 酶，Argonaute 蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha 、RISC 、TRBP 和PACT 。
术语描述 siRNA 小干扰（siRNA ），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA 干扰，通过与目标mRNA 互补结合序列特异性地实现mRNA降解。
shRNA 短发夹RNA （shRNA ） ，包含一个环结构，可加工成siRNA ，也可通过与目标mRNA 互补结合序列特异性地实现靶mRNA 降解.Drosha 是一种核糖核酸酶III 的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA 。
RNAi基因沉默的动力学研究进展
ｐ ｏｅ ｇ ｎ ｔｅ２ 裂解 靶 基 因 ｍＲＮＡＩ 。Ｒ ｒｔｉ Ａｒｏ ａｕ ） ｎ ２ ］ ＮＡ
干扰 以其序 列特异 性 的优势 被广泛 应 用 于阻 断或 抑
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的研究 工 具 。在 Ｒ ＮＡｉ 挥 基 因沉 默 效 能 的 过 程 发 中 ， 多 因素都会 直 接 或 间 接 的影 响最 终 的沉 默 效 许
默 效能 的过 程 中， 多 因素都会 直接 或 间接 的影 响 最 终 默 效 率 和 沉默 时 间 。论 文从 ｓ 许 的沉 ｉ ＲＮＡ 类 型 的 选
择 、ｉ ＮＡ 的递 送和 细胞 内的 Ｒ ｓ Ｒ ＮＡｉ 途径 ３个 方面 对 Ｒ ＮＡｉ 径 中各 个 影响 其 效 能发 挥 的 因素及 其解 决 方 途 法做 一综 述 ， 同时对描 述 Ｒ ＮＡｉ 因沉默 动力 学的数 学模 型及其 应 用进 行 了介 绍 。 基 关键词 ： Ａ 干扰 ； 小 干扰 ＲＮＡ； ＲＮ 短 短发 夹 Ｒ ＮＡ； 因沉默 ； 学模 型 基 数
综述， 以期 能 帮 助 人 们 更 深 入 地 认 识 Ｒ ＮＡｉ促 进 ，
化过 程 中 ， 高度 保 守 的 双 链 ＲＮＡ （ ｏ ｂｅｓｒｎ 由 ｄ ｕ ｌ—ｔａ — ｄ ｄＲ ｅ ＮＡ， ｓ ｄ ＲＮＡ） 诱导 同源 ｍＲ ＮＡ 高 效 特 异性 降
解 的现象＿ 。它是 生物 体抵 御外 来感 染 的一 种重 要 １ ］ 保护 机制 ， 为此 Ｒ ＮＡｉ Ｓ ｉ ｃ ） 志评 为 ２ ０ 被《 ｃｅ ｅ 杂 ｎ ） ０ １年 十大 科 技 突 破 之 一 ， 列 ２ ０ 名 ０ ２年 十 大 科 学 之 首 。 ２０ ０ ２年 Ｎａｕ ｅ 志 亦将 Ｒ ｔｒ 杂 ＮＡｉ 为 年度 重 大科 技 评
vigs基因沉默原理和rnai沉默
vigs基因沉默原理和rnai沉默VIGS基因沉默原理和RNAi沉默是两种常用的分子生物学技术，被广泛应用于研究植物基因功能。
它们有些相似之处，同时也存在一些差异。
本文将对这两种技术的原理、应用和优缺点进行详细探讨。
1. VIGS基因沉默原理VIGS（Virus-induced gene silencing）是通过病毒侵染植物细胞，诱导宿主植物基因的沉默。
该技术利用了病毒的复制和传播机制，将目标基因序列整合到病毒基因组中，并且在感染的植物细胞中产生可复制的RNA介导的沉默效应。
具体步骤包括：（1）构建VIGS载体：将目标基因的部分序列插入病毒载体，形成VIGS载体。
（2）VIGS载体侵染植物细胞：将构建好的VIGS载体导入病毒感受性植物中，让病毒基因组中的目标基因RNA与宿主植物基因的mRNA互补杂交，导致宿主基因沉默。
（3）基因沉默效应：病毒RNA会在植物细胞中被RNA依赖性RNA 聚合酶复制成多个复制体，随后通过系统性运输到植物全身，触发整个植物的基因沉默效应。
2. RNAi基因沉默原理RNA干扰（RNA interference）是一种保守的基因沉默机制，通过切割目标mRNA分子而将其降解，从而实现对基因表达的调控。
RNAi主要通过siRNA和miRNA两条途径实现。
具体步骤包括：（1）siRNA的产生：长双链RNA被核酸酶Dicer切割成短双链siRNA。
（2）siRNA的介导：siRNA将RISC（RNA诱导的沉默复合体）导入到靶基因mRNA上，使其降解。
（3）miRNA的产生：由miRNA基因转录出的pri-miRNA在细胞核中被核酸酶Drosha切割为pre-miRNA，经过转运到细胞质后被Dicer 进一步切割成短miRNA。
（4）miRNA的介导：miRNA与RISC结合后能够通过完全或不完全互补靶序列的mRNA上结合，从而通过诱导转录后调控蛋白质的翻译或降解。
3. VIGS和RNAi的异同点（1）机制差异：VIGS是依赖于病毒的复制和传播来诱导植物基因沉默，而RNAi是通过siRNA和miRNA介导的沉默机制来调控基因表达。
RNA干扰技术的应用及其局限性
RNA干扰技术的应用及其局限性RNA干扰技术，简称RNAi技术，是一种基因沉默技术，可用于调控、研究基因表达，也被广泛应用于治疗基因疾病、抗癌等领域。
然而，RNAi技术也有其局限性，在应用过程中需要注意一些问题。
一、RNA干扰技术的应用1. 遗传功能研究：利用RNAi技术将特定基因的表达沉默，可以诱导基因敲除或部分失活，进而研究基因在生理生化过程中的作用。
2. 生物制药： RNAi技术被用于制备某些生物制剂，如抗癌药物和疫苗，以便更好地从疾病中恢复健康。
3. 治疗基因疾病： RNAi技术可以用于治疗基因疾病，例如肝胆疾病、糖尿病等。
它可以靶向特定的基因序列，然后暂时沉默目标基因，以达到缓解症状的效果。
4. 抗癌： RNAi技术被广泛用于抗癌领域。
它可以靶向肿瘤相关基因，抑制肿瘤细胞的增殖和扩散，从而达到治疗癌症的目的。
二、RNA干扰技术的局限性1. 不稳定性：RNAi技术的转染效果通常持续不久，因为RNAi只通过RNA干扰来降低特定基因的表达，而RNA的稳定性差，容易被酶降解，失去干扰作用。
2. 靶向效率低：RNAi技术需要非常精准的靶向，如果靶向错误，甚至可能有副作用。
然而，由于RNA序列相同或相似的基因广泛存在，靶向效率很低，而且RNAi技术只能消耗，无法低效的基因也可能因RNAi技术而被降低表达。
3. 难以转染： RNAi技术需要将RNA分子引入靶细胞内，但转染效率甚至低至1%-5%，特别是对于成体细胞。
因此，使用这种技术的疗法无法达到理想的治疗效果。
4. 免疫反应：RNAi技术还可能会诱导系统性的免疫反应，这可能会影响RNAi技术的应用，不能长时间使用。
三、掌握RNA干扰技术的注意事项1. 选择合适的靶向序列：选择合适的靶向序列是RNAi技术成功的关键。
靶向序列需要选择独特的、在细胞内广泛表达的基因，以提高干扰效率和减轻副作用。
2. 选择合适的信噪比检测方法：使用RNA干扰技术需要较死的检测方法来检测靶基因的表达或沉默，以监测RNAi技术的有效性和是否产生异常细胞反应。
shrna沉默基因原理
shrna沉默基因原理shRNA（short hairpin RNA）是一种可以用来沉默基因表达的分子工具。
shRNA的原理是利用RNA干扰技术（RNA interference, RNAi），通过特异性地靶向特定基因的mRNA，从而抑制该基因的表达。
shRNA分子通常由一个短的RNA序列构成，具有一个短的双链RNA结构，类似于siRNA（small interfering RNA）。
shRNA通过与RNA诱导的基因静默（RNA-induced gene silencing）的机制相互作用来实现对基因表达的沉默。
shRNA沉默基因的原理主要包括以下几个步骤：1. 设计shRNA序列，首先需要设计一个能够特异性靶向目标基因的shRNA序列。
这需要对目标基因的mRNA序列进行仔细的分析，以确保shRNA能够精准地与目标基因的mRNA结合。
2. 载体构建，设计好的shRNA序列会被克隆到适当的载体中，通常是质粒或病毒载体。
载体还会包含一些调控元件，如启动子和终止子，以确保shRNA能够在细胞内得到适当的表达。
3. 转染或转化，构建好的shRNA载体会被导入到目标细胞中，可以通过转染或转化的方式实现。
一旦进入细胞内，shRNA会被细胞的机制识别并转录成小分子RNA。
4. RNA诱导的基因静默，转录成的shRNA会与RNA诱导的基因静默复合物（RISC）结合，从而形成RNA诱导的基因沉默复合物。
这个复合物会识别并结合目标基因的mRNA，导致mRNA的降解或翻译抑制，最终导致目标基因的表达被沉默。
总的来说，shRNA沉默基因的原理是利用特异性的RNA干扰技术，通过设计和导入特定的shRNA序列，来干扰目标基因的表达，从而实现对基因功能的研究和调控。
这种技术在基因功能研究、疾病治疗等领域具有重要的应用前景。
vigs基因沉默原理和rnai沉默
vigs基因沉默原理和rnai沉默VIGS（Virus-induced gene silencing）基因沉默和RNAi（RNA interference）沉默都是生物学研究中常用的方法，用于研究基因的功能和调控机制。
它们共同的原理是通过引入相应的外源RNA分子来诱导靶基因（target gene）的沉默，从而研究基因在细胞与整个生物体中的功能。
虽然二者的原理有所不同，但它们在生物学研究中都发挥着重要作用。
VIGS（Virus-induced gene silencing）基因沉默是通过利用病毒来传递RNA分子，并引发对应的基因沉默的一种方法。
这种方法最早是在植物领域中发现的，后来也在许多其他生物中得到应用。
VIGS 的基本原理是通过将目标基因片段插入表达病毒载体中，然后通过病毒感染植物或动物细胞，利用病毒的复制过程来产生RNA分子，从而导致目标基因的沉默。
这种沉默通常是由于RNA分子通过切割或RNA-DNA相互作用等机制，导致目标基因的mRNA降解，或抑制其翻译成蛋白质，从而实现基因沉默的目的。
相比之下，RNAi是一种借助内源的RNA分子来诱导基因沉默的方法。
它是由一种特殊的RNA分子，即小干扰RNA（siRNA）和微小内源RNA（miRNA）介导的细胞内调控机制。
这些RNA分子通常由一类酶称为Dicer切割出来，该酶能够将双链RNA分子切割成约20-25个碱基对（bp）长度的小分子RNA。
这些小RNA分子与靶基因的mRNA结合，并通过RNA诱导的合成酶（RISC）复合物的作用，将靶基因的mRNA切割成短片段，从而抑制目标基因的翻译过程，实现基因沉默。
不同于VIGS基因沉默方式，RNAi机制更加普遍，并广泛存在于真核生物细胞中。
VIGS和RNAi基因沉默技术在生物学研究中的应用非常广泛。
通过利用这些技术，研究人员可以选择特定的靶基因，并通过适当设计的RNA分子来诱导其沉默。
这些研究通常通过研究目标基因沉默后的表型变化来揭示基因的功能和调控机制。
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发育生物学翻译 chapter 6 李鸿生 08420421018 生命学院 1 / 12 人工miRNA定向基因沉默 摘要：描述一个基因的功能通常包括对功能丧失等位基因的详细的分析。在模式植物例如拟
南芥和水稻中，插入序列索引的收集为潜在无效等位基因分析提供了很大帮助，而这些都可以通过网站(e.g., http://signal.salk.edu)容易的获取。然而，这对于非模式生物是不可能的，要研究非模式生物，需要敲除大量的同系物，而且部分缺失基因功能或者调节缺失基因功能不容易应用，然而当无效等位基因是致死的时，这种方法却很有效。采用定向基因沉默技术的转基因途径可以替换无效等位基因，也可以用于基因功能的精细研究，例如，通过组织特异性的和可诱导的基因沉默。 这一章将阐述人工miRNA的产生以及人工miRNA(amiRNAs)作为基因沉默工具在不同植物物质中的应用。 1.介绍 导的基因沉默的介导物是单链沉默RNA（19-23个核苷酸），它能与靶转录物碱基互补配对。小分子RNA（miRNA），一类沉默RNA，来自于转录物的特定发夹结构。包含发夹结构前体的载体是第二代RNAi载体。??这些载体可以作为反求遗传学工具来定向基因沉默，这在非模式生物系统中也可以。它们的特异性应用是暂时的和组织特异性的基因沉默，还有一些相关基因的共同沉默。这些相关基因包括紧密连锁是基因和那些等位基因和特异性结合的基因。另外，如果对靶位点沉默突变后，人工miRNA介导的基因调解也不再起作用，但是，用这些载体来对这些靶基因进行表型互补却有可能。WMD网站大大促进了适合不同植物的amiRNA的设计，除此之外，引物序列的设计需要修饰miRNA载体。我们将介绍这个工具的使用以及设计载体培育转基因植物的必要分子的步骤。 2．材料 2.1amiRNA序列的预测 1．要沉默的靶基因的序列和标记（或者EST名）。
2.2通过PCR定向诱变 1. 六寡核苷酸：两个是对载体普遍的（A 和 B，表一），四个是特异修饰的。它们的序列是amiRNA设计程序的输出结果。 2．模板质粒：PRS300（包括Arabidopsis athMIR319a）或者PNW55（包括水稻osa-MIR528）
3.进行PCR，琼脂糖凝胶电泳，以及凝胶提取所需的装置和化学试剂。 发育生物学翻译 chapter 6 李鸿生 08420421018 生命学院
2 / 12 2.3克隆amiRNA前体 1．商品化的PCR产物连接套件（例如来自Invitrogen的TOPO kits），或者标准的克隆质粒（例如来自Promega 的pGEM-7Z，用Sma I线性化），10mM ATP,限制性内切酶SmaI 2．T4 DNA连接酶。 3.标准E.coli的感受态细胞(DH5a, TOP10)。 4．含有适量抗体的LB板 5.质粒提取溶液或套件（QIAprep from Qiagen)。 6.测试阳性克隆和亚克隆aMIRNAs的限制性内切酶酶。 7.含有启动子和终止子的二元质粒。 2.4 植物转化和转基因植物分析 1.标准的有活力的根瘤农杆菌菌株（如，用于拟南芥的GV3101,用于亚洲栽培稻的LBA4404或EHA105） 2.产生转基因植物所需的标准设备 3.选择性标记和适当的抗体（例如，卡那徽素，匀霉素） 4. TRIzol®试剂或者商品化的RNA提取套件（例如，RNeasy from Qiagen） 5.PT-PCR所需的逆转录酶套件(e.g., SuperScript III from Invitrogen)和寡核苷酸 6.可选择的试剂： ——mRNA的套件(e.g., Oligotex from Qiagen)与5’RACE(e.g., GeneRacer from Invitrogen) ——通过位点直接突变产生转基因包括表型互补靶基因沉默突变所需的寡核苷酸。 3．方法 方法部分将详细介绍用于沉默不同植物中我们感兴趣的一个或多个相关基因的amiRNA的设计与构建。可细分为四个部分： （1） 计算机辅助设计最佳的amiRNA序列。 （2） 通过位点定向突变产生amiRNA前体。 （3） amiRNA前体的克隆。 （4） 转基因植物的产生与分析。
3.1设计amiRNA序列 amiRNA序列应该从高效性和特异性两方面进行优化。特异性的最佳化（例如，预测和避免偏靶点）依赖于转录子序列信息的可利用性。我们已经开发了Web MicroRNA Designer（WMD），可通过http:// wmd3.weigelworld.org.访问。它预测出许多植物物种基因沉默所需的合适的amiRNA序列，这些植物的基因组全序列已经在WMD中注释或者重要的EST/cDNA序列信息是可利用的。笔记1描述了怎样给那些不包括在WMD里的植物设计人工amiRNA序列。 3.1.1实验设计 WMD既可以设计amiRNA沉默单个基因，也可以设计能够同时沉默多个基因的amiRNA。这些基因需要共有核苷酸序列高相似性区域。WMD选择与靶基因局部的互补的amiRNA，而且还必须保证各个物种的基因组/转录物组中没有其它已注释基因释放完成有益的miRNA靶反应的标准。这些标准是人们经验性的结论，希望能够通过加深对miRNA生物学和其功能的研究来进一步完善。意识到如果amiRNA能结合的所有的可能的靶位点在其他物种里也存在的话，我们就认为不可能设计一个amiRNA来沉默一个或者几个高度相关的基因很重要。因此在开始设计之前，仔细搜索高度相似性基因就显得尤其重要。这项工作可以借助于WMD网页中的BLAST搜查工具完成。如果高度相关基因的靶点不干扰实验，这些可以认为是“已证实的偏靶点” （“accepted off-targets.”），以此来增加amiRNA设计成功的几率。 发育生物学翻译 chapter 6 李鸿生 08420421018 生命学院 3 / 12 3.1.2使用amiRNA设计工具（WMD- Designer Window) WMD需要指定的靶基因序列信息作为输入信息，然后从反互补序列中选择21mer amiRNA。为了适应不同格式的序列注解和amiRNA不同的应用，将“靶基因”输入到WMD-Designer 有不同的途径： 1．在完全注解基因组中沉默一个基因或多个基因：对于这些基因，对于完全注解的基因，足够提供基因的标示包括剪接突变，例如，用于拟南芥或水稻的At1g23450.1 或 Os01g24680.1。 2．沉默只有EST信息可利用的物种中的单个基因或多个基因： 需要提供位置标志（如EST名称），而且标志物必须与WMD用的标志物一致。用WMD-BLAST工具进行搜索很容易得到正确的名字。多EST序列经常需要单基因座，首先，他们都需要通过WMD-BLAST工具进行鉴定，然后，它们中的一个（最长的最好）将被作为靶基因（在“Target genes”区输入的标志物），此外，可能起源于同一个基因座的其它所有标志将会作为“已证实的偏靶点”（用逗号隔开）输入。当尝试同时沉默多个基因时，每个基因的一个序列输入到“Target genes区域，而其它的将被列入“已证实的偏靶点靶点”中。 3．当没有一个多余的EST组成全长的靶转录物时，可以将几个EST连接起来作为amiRNA设计的靶点。这要给定一个特制的能从其他已注释ESTs的识别出连接起来的EST的标志物，而所有多余的EST则需被特化为“已证实的偏靶点靶点”。连接起来的EST需要在FASTA格式中进入靶基因区域。 4．剪接形式特异性沉默： 如果只有一种剪接形式被靶定，那么一个对各自的剪接形式是唯一的DNA序列（大于21个核苷酸的寡核苷酸，FASTA格式）应该作为靶点，而且标志物/剪接形式的名称(e.g., At2g23450.2)将会作为标题。 5．未注解的基因和序列变体： 如果要被沉默的基因没有包括在WMD数据库中（例如，GUS,GFP,病毒基因，未注解的基因等），或者是一个已注解基因的变异体（例如不同生态型或者品种的等位基因），那么靶基因序列应该用FASTA格式，然后以一个与任何一个以注解的基因不同的名字作为标题。沉默序列变异的基因也需要将相关的等位基因特异化为已确认的偏靶点，除非要想得到等位基因特异性沉默。 在各种情况中，各个植物种或者基因组都是从WMD设计者页面的下拉菜单中选择出来的，这样就可以保证其在同种序列中的特异性。当有两个以上的基因同时被沉默时，“包括的最少靶量”的说明就很重要了。要想找到一个能同时沉默所有基因的amiRNA, WMD会试图产生可以结合所有可能基团的amiRNAs，而这些可能基团的规模必须比“最少靶量”要大或者相当。 计算amiRNAs会花几分钟到几小时的时间。结果会发到指定的邮箱里，邮箱地址填写在主题栏的“说明”项里。 3.1.3 amiRNA设计结果的处理 邮件中的amiRNA结果含有连到结果网页的超链接，这个网页上列有amiRNA序列。这个列表也可以下载来为以后参考所用（Excel格式）。当结果页是空白时或者遇到“抱歉，WMD3不能设计任何amiRNAs时”请参考笔记3。 原则上，所有WMD设计出的amiRNA序列都满足以上的标准，并能成功沉默靶基因。然而它们在碱基组成和与靶基因的杂交特征上并不遵循我们所认为的最佳参数，而是另一种特殊的标准（详参（6））。因此，可能的amiRNA