植物转基因方法及特点和转基因沉默现象_崔广荣
植物转基因沉默的机制、对策
3．位臵效应
目前的转基因方法整合到基因组中的位臵是随机 的，因基因组中染色质的分布不均衡，外源基因 整合到目的基因组即染色体的物理位臵就直接决 定着外源基因的表达，这种情况称为位臵效应 （position effect）
（ 1 ）外源基因插入染色体中高度甲基化的区 域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基 因沉默。 （ 2 ）外源基因的碱基组成与整合区域的不同 而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录 使基因沉默，这两种情况都属于转录水平上调 控的转基因沉默。
RNAi 发现历程：
1990年，Napoli等将1个查尔酮合成酶基因（chs）置于1 个强启动子后导入矮牵牛，试图加深花朵的紫颜色。但
意想不到的事发生了：结果部分花的颜色并非期待中
的深紫色，而是花瓣形成了花斑状甚至白色，而且这种 性状可以遗传。
??
1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫(C.elegans)为消除线虫第 一次分裂的不对称性的研究中，利用反义RNA技术抑制par-1 的表达，同时也注入正义RNA（对照）。结果两种方法都抑 制par-1基因。 该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。
转基因植物的生产
抗除草剂作物
抗虫玉米
抗虫棉花
转查尔酮合成酶矮牵牛花
抗CMV病毒转基因番茄
抗CMV病毒转基因甜椒
bacterial speck disease(细菌斑点病）. Plant on left has been genetically engineered with a gene for resistance to the disease, and plant on right is a susceptible, nonengineered variety.
转基因沉默
• 主要观察转化子在添加相应抗生素或除草 剂培养基上的生长
• 抗的存活，不抗的死亡
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NPTⅡ活性检测
• 目的 ：检测NPTⅡ基因在植物组织中的表达 • 原理： NPTⅡ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，
影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时 使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移， 生成放射性的卡那霉素来检测。 • 检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法 • NPTⅡ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放 射自显影
• 检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微 镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植 株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿 色荧光蛋白检和定位。
6
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GFP在水稻原生质体中的瞬时表达结果
不含有OSPK1基因的 原生体pUC-GFP
含有OSPK1基因的原生 体pUC-OSPK1-GFP
转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色 荧光，而转化含有OSPK1基因质粒的原 生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上
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3、转基因植物分子检测
• PCR • Southern blotting • Northern blotting • RT-PCR • QRT-PCR • Western blotting
荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG
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组织化学染色定位法检测GUS
• 以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物 水解成蓝色物质，
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gfp基因的检测
• 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光 素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内， 能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与 目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解 目的基因表达情况。
一文看透转基因
一文看透转基因01、揭开转基因技术迷雾杂交育种为何不能解决所有问题？在中国农业领域，杂交育种技术格外有名，通过几十年的努力，袁隆平、朱英国等科学家不断创出主粮亩产的新高，还打造出不少新品种，实现了主粮自给自足。
转基因技术看似并非必需之选。
生物育种是利用现代生物技术等方法创造遗传变异并培育生物新品种的过程。
卢宝荣介绍说，传统杂交育种本质上也属于“转基因”范畴，主要通过有性杂交方式，将基因从具有优异性状的供体植物转移到目标植物上，供体植物往往是科学家偶然找到的具备特殊本领的农家传统品种和野生近缘种，它们能抗虫、耐寒，或者富含某种营养成分。
但有性杂交方式比较耗时，效率较低，最大困难是难以逾越物种间的生殖隔离来转移优质基因。
科学家们曾有过一个梦想，希望将西红柿和马铃薯进行杂交，让植株长出又大又红的西红柿，地下还可长出特别大的马铃薯，但无法实现。
要想跨越物种之间的生殖隔离，从亲缘关系较远的物种上获得优质基因，就要用到转基因技术，它可以提供广阔的选择空间，使得农作物获得大量其他物种的优质基因。
福建省农业科学院水稻分子设计创新团队首席专家王锋研究员在转基因水稻研究领域工作了整整30年，这些年他在研发对抗草地贪夜蛾的转基因水稻品种。
“草地贪夜蛾是入侵物种，对玉米和水稻的危害严重，抗药能力很强，在水稻种质资源中，没有针对鳞翅目害虫的抗虫基因资源，不能通过杂交育种方式培育抗二化螟、草地贪夜蛾等的品种，最后的防守方法是转基因技术。
”王锋说。
早在1992年，转基因技术就曾临危受命。
当年棉铃虫肆虐，农药无法杀灭，也无抗虫能力的野生棉花品种可用于杂交，直接经济损失达到60多亿元。
“在束手无策之际，转基因抗虫棉花品种被投放到市场，在挽救产业过程中起到了关键作用。
”复旦大学生命科学学院卢大儒教授回忆道。
转基因技术潜在危害究竟在何方？食用转基因食品会造成各种疾病？前些年，关于转基因食品的安全问题被不断提及。
但在科学家眼中，这似乎缺乏科学依据。
【精品】植物转基因原理与技术
植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程.微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。
自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。
下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。
原理根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。
在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。
以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。
外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。
受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同,可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。
一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系.植物转基因流程图如下所示。
外植体）愈伤组织瞬时表达外源基因植物受体细胞原生质体生殖细胞稳定表达获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定(PCR，Southernblot，Northernblot，生理指标鉴定等)技术就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术,直接转化技术和种质转化技术。
下面分别叙述。
一载体转化技术载体转化技术是指通过农杆菌的Ti或Ri质粒,植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法.其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法.病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。
土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌.它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒.它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”—冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。
植物细胞转基因技术
适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株； 可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴定
时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快
捷； 转化速度较快，变异性状稳定较快； 方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。
01
03
02
缺点： 转化受体受植物花期的限制，同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。 在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。 操作的经验性很强,需要一定的技巧。 利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界是 T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重
DNA
1
2
3
4
5
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vir基因
Ti 质粒的 vir 区大小为30kb ,分 VirA 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7 个操纵子,一共有24 个 基因共同控制着 T -DNA 的加工和转移,它们总 称调控子。
4.化学物质诱导法
01
优点：
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PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性
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好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很
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少产生。
缺点： 原生质体培养再生难度较大； 原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白 化苗，且由于 PEG法对原生质体活力有害，转化 率低。 应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡 椒等植物的转基因植株。
电击法
DNA 混合入电击缓冲液 幼苗
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优点： 操作简便，可以一次转化许多原生质体，转化效
率较高，特别适于瞬间表达。
缺点： 有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。
植物转基因沉默与消除
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植物学通报
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作者简介： 崔欣， 作物遗传育种专业硕士研究生， 研究方向为植物转基因。导师杨庆凯， !PQR 年生， !P$P 年生，教 授， 博士生导师， 国家级有突出贡献的中青年专家， 国务院学位委员会作物学科评议组成员， 农业部教学指导委员 会作物学科组委员， 国家大豆工程中心副主任， 中国作物学会理事， 中国作物学会大豆专业委员会副理事长。主 省部级奖 " 项。出版了 R 部著 持了国家自然科学基金 S 项重点项目， " 项面上项目。荣获国家科技进步奖 S 项， 作， 发表大豆遗传育种等论文 "# 多篇。 收稿日期： 接受日期： 责任编辑： 刘 晖 S##!2!#2!" S##S2#S2SQ
转基因植物的方法
转基因植物的方法转基因植物是指通过人工手段将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物的方法主要包括以下几个步骤：1. 基因克隆基因克隆是指将所需的基因从外源生物中分离出来，并将其插入到载体DNA中。
载体DNA是一种能够自我复制的DNA分子，通常采用的载体有质粒、噬菌体等。
基因克隆的过程需要利用限制性内切酶切割DNA，将所需的基因与载体DNA连接起来，形成重组DNA分子。
2. 转化转化是指将重组DNA分子导入植物细胞中，使其成为植物细胞的一部分。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法。
农杆菌是一种能够感染植物的细菌，通过将重组DNA分子导入农杆菌中，再将农杆菌接种到植物体内，使其将重组DNA分子导入植物细胞中。
3. 选择选择是指通过筛选，将转化成功的植物细胞筛选出来。
为了使转化成功率更高，通常会在重组DNA分子中加入一些标记基因，如抗生素抗性基因等。
在转化后，将植物细胞培养在含有抗生素的培养基上，只有转化成功的细胞才能够生长下去，从而筛选出转化成功的植物细胞。
4. 培育培育是指将转化成功的植物细胞培养成完整的植物。
在培育过程中，需要对植物进行筛选和鉴定，以确保其具有所需的性状。
同时，还需要对植物进行基因检测，以确保其基因组稳定性和安全性。
转基因植物的方法虽然可以为人类提供更多的食品和药品，但也存在一定的风险。
因此，在进行转基因植物研究和开发时，需要严格遵守相关法律法规，确保其安全性和可控性。
同时，还需要加强对转基因植物的监管和管理，以保障公众的健康和安全。
植物转基因沉默的机制及克服方法
植物转基因沉默的机制及克服方法专业:植物学学号:220100905010 姓名:潘婷摘要:植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用,转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。
使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。
关键词:转基因沉默;外源基因;DNA甲基化;共抑制1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后,研究者对转基因沉默进行了许多深入探索,以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。
1 转基因沉默机制转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。
1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制1.1.1 甲基化作用从目前报道看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关,DNA甲基化都是从启动子区域开始的,主要发生在基因5’端启动子区域。
甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上,C碱基甲基化不是转基因沉默前提,但对维持基因沉默是必需的。
甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。
1.1.2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。
研究发现,转基因烟草中稳定表达的T-DNA至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻,并且位于端粒附近。
而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。
1.1.3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。
重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。
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2 转基因植物中的基因沉默现象 如前所述, 植物转基因技术在基础和应用研
究中都 展示了巨大的 潜力。但是近 年来人们发 现, 几乎在所有的转基因方法得到的转基因植株 中, 都有外源基因在整合进基因组后出现基因沉 默( gene silence) 现象[ 11] , 转基因在受体植株中的 表达水平很不稳定。这已经成为植物遗传转化技 术应用于基础和应用研究的严重障碍。因此, 研 究外源基因沉默的分 子机理及其相 应的解决方 法, 已经成为当代分子生物 学研究的一个热点。 目前对转基因植物中的基因沉默现象已经有了较 为深入的研究, 但对其分子机理的理解及相应的 控制手段还很有限。
基因 枪法( particle gun bombardment ; microprojectile bombart ment ; biolist ics) 是 1987 年由美 国康奈尔大学的 Sanford 提出的一种直接基因导 入法, 它避开了原生质体再生植株培养的困难和 当时人们认为的所谓的农杆菌的宿主限制问题。 这种方法是借高速运动的金属粒将附着于其表面 的核酸分子引入受体细胞, 然后通过组织培养再 生出完整植株。由于基因枪法导入外源基因的技 术本质上是一种物理过程, 因此它具有不用原生 质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限 制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因 植株变异 率低、通常具 有正常的育性 等优点[ 1] 。 特别是在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的 应用。但是基因枪法也有自身的缺点: 转化效率 不高, 大多在 0. 1~ 1. 0% 的范围内, 难以选择; 外 源基因序列常是多拷贝插入, 从而导致基因沉默; 转入的基因有时是呈非孟德尔遗传; 费用较高 等[ 4] 。 1. 2 PEG 法
自 1983 年利用农杆菌转化获得首例转基因 烟草以来, 农杆菌介导的基因转化重要环节已形 成了相当成熟的实验流程, 在油料、糖料、纤维、花
17 卷第 1 期
崔广荣, 植物转基因方法及特点和转基 因沉默现象
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卉、果树、蔬菜、林木、谷类等植物中均获得了转基
因植株。据统计至今获得的 转基因植株中 80% 以上是农杆菌介导 转化法获得的[ 2] 。农杆菌转 化的具体操作方法也多种多样, 如直接感染植物 伤口法、叶盘法、原生质体共培养法、真空容器中 浸染完整植株[ 14] 、愈伤组织共培养等。由于单子
转基因植株表型
转移 DNA 片段大小
农杆菌法
PEG 法
原生质体组织 细胞完整植物
原生质体
有
无
有或无、较简单 复杂
较高
低
简单
简单
简单
简单
单拷贝较多 复杂
单位点多
多位点
稳定
不稳定
较清楚
不清楚
较少
较多
表型单一 较稳定
表型丰富 不稳定
较大
较小
电击法
原生质体
无 复杂 低 复杂 复杂昂贵 复杂 多位点 不稳定 不清楚 较多 表型丰富 不稳定 较小
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安 徽技术师范学院学报
2003 年
PEG 法是一 种通过化 学物质 P EG ( 聚 乙二 醇) 处理去壁的原生质体作为转化受体, 改变细胞 膜的通透性而使原生质体获得转化。Krens 等首 次通过此法在烟草中获得成功。此后许多人在双
子叶和单子叶植物如烟草、矮牵牛、水稻、玉米等
作物上都获得了成功。由于 PEG 法具有实验成 本低廉、结果也较稳定、重复性好、无需特殊的仪 器设备等特点, 因而在发明起初也成为应用较为 广泛的方法。但是此法具有明显的缺点: 原生质 体培养再生难度较大; 受基因型限制; 原生质体再 生培养的转化植株变异率高, 易产生白化苗; 转化 率低[ 4] 。
关键词: 植物转基因; 基因沉默 中图分类号: Q943. 2 文献标识码: A 文章编号: 1007- 3302( 2003) 01- 0037- 05
自从 1983 年第一个转基因植株问世以来, 植 物转基因技术日益得到广泛的应用, 已经成为植 物生物技术的核心 工具之一[ 4] 。它对 于分子生 物学、分子遗传学等基础研究和植物的遗传改良 都具有特别重要意义。如今世界上许多国家都投 入了大量的人力和物力进行植物转基因方面的研 究, 中国也于 1999 年设立了植物转基因及应用专 项基金。据 Janes 的统 计资料, 1986~ 1997 年间 已有 45 个国家在 60 多种作物上进行了近 25000 例转基因植物的田间试验[ 13] 。到 1997 年底, 全 球已有 12 种作物的 48 种转基因作物产品获准进 行商品化生产, 据估计全球范围内转基因产品的 市场销售额将由 1986 年的不足 5 亿美元增加到 2000 年的 20~ 30 亿美元; 2010 年将增加到 200 亿美元[ 13] 。在植物遗传改良应用上, 与传统育种 手段相比, 转基因技术有其自身独到之处: 它不仅 可以缩短育种年限, 加快育种进程, 而且可以打破 种间基因交流的界限, 广泛利用植物、微生物、甚 至动物的基因来使植物获得抗病性、抗虫性、抗逆 性、提高产量、改善品质、人工创造雄性不育系、制 造植物反应器等[ 3] 。 1 植物的遗传转化方法及特点
件下, 细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔, 为外 源物质提供了通道, 借此导入 DNA 等遗传物质, 达到转化的目的。激光法同电击法类似, 一定波 长的激光聚焦后直径达 0. 3~ 0. 5 微米时, 高能量 的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔, 短时间内 又可自动 修复, 因 而可利用激光 束将外源 DNA 导入到细胞中。Weber 等利用此法将荧光素酶基 因导入油菜叶绿体中, T oper 转化烟草、中国的傅 荣昭等转化小麦均 获得成功[ 2] 。激光 法和电击 法均可用于双子叶和单子叶植物, 转化受体材料 广泛。但这种方法的效率低是显而易见的, 使用 范围小, 存在问题较多, 发展缓慢。 1. 4 花粉管通道法
本科 粮 食作 物的 遗 传转 化 方面 还 存在 许 多局 限[ 18] 。
由上所述, 各种基因转化方法都有自己的优 点又有自己的不足, 列表 1 比较如下。
表 1 常见植物转化方法 特点比较
受体材料
有无寄主范围 培养条件 转化率 操作程序 设备要求 目的基因拷贝数 目的基因插入位点 稳定性 基因整合机制 基因沉默
1. 3 显微注射法、电击法及激光法 显微注射法( microinject ion) 是用显微注射器
将遗传物质注射到培养细胞中, 通过组织培养最 终获得 转化植株。此 项技术起初主 要应用于动
物, 八十年代中期开始应用 于植物的遗传转化。 虽然该法具有 DNA 注射的准确性、预见性、克服 远源杂交的困难等优点, 但其又有工作效率低、表 达不稳定等缺点, 故其应用受到了限制。自基因 枪法诞生以来, 这种转化方法在植物上的应用走 入了低谷[ 2] 。电击法( elect roporat ion) 是八十年代 初发展起来的一种转化技术, 首先在原生质体上 运用此法将 CAT 基因( 氯霉素乙酰转移酶基因) 转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并 得以表达[ 2] 。此法的主 要原理是在高 压脉冲条
植物基因工程研究中的关键步骤之一是通过 特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内, 使
收稿日期: 2002- 11- 30 崔广荣: 男, 1965 年出生, 讲师, 硕士, 农学专业
之发生定向的、永久性的遗传变异, 即所谓的植物 遗传 转化 ( genet ic t ransf orm at ion) 。为 了方 便有 效地将外源基因导入植物体内, 人们不断地探索、 发展新的植物遗传转化方法。目前发展较为成熟 的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、P EG 法、花粉管通道法、微注射法、激光法等, 其中基因 枪法和农杆菌介导法是最为有效的两种方法。 1. 1 基因枪法
农杆菌是一种革兰氏染色阴性菌, 普遍存在 于双子叶植物中。农杆菌属共分为四个种, 即根 癌农杆菌、毛根农杆菌、放射性农杆菌、和旋钩子 农杆菌。目前研究较多的是根癌农杆菌( agrobact erium tumef aciens AT ) 和 毛 根农 杆菌 ( agrobact erium rhizogenes AR) , 它们 都可以 浸染植 物细 胞, 但引起不同的病症, 根癌农杆菌常引起植物近 地面的根茎交界处形成帽状的肿瘤。科学家们经 过长期的研究发现, 农杆菌中存在一种环状的、大 小约 150 ~ 200kb 的 质 粒 ( tumor- inducing plasm id, 简称为 T i 质粒) , 植物肿瘤即是有 T i 质粒上 的一段 DNA 引起的, 它通过特定的机制复制、切 割、转移、整合到植物基因组中并表达, 从而引起 肿瘤的发生, 这段 DNA 称为 T - DNA( t ransferred DNA) , 是一种天然存 在的遗传转化体 系。人们 利用这种遗传转化体 系将外源基因 导入植物细 胞, 并利用植物细胞的全能性, 通过组织培养, 由 一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株, 此即农杆菌介导的遗传转化( agrobacterium- med-i ated transfermat ion) [ 18] 。农杆菌 T i 质粒 的 T DNA 中带有 Onc 基因( 致癌基因) , 它在植物细胞 内编码植物生长素和细胞分裂素, 使受浸染的植 物细胞不受 限制地增殖而致瘤。此外 T - DNA 还编码 Opine 类化合物, 作为农杆菌代谢的氮源 和碳源。T i 上的 T- DNA 是由两端两个不完整的 25 个碱 基对的 顺向 重复序 列所界 定, 由 于 T DNA 不含编码促使自身转移物质的基因, 故可将 其上的 Onc 基因及其它不必要的序列去掉, 而插 入要转化的目的基因序列, 从而达到既不致使植 物致瘤而又能改良植物的目的[ 18] 。
花粉管通道法( pollen- t ube pat hw ay) 又称子 房注射法( overy inject ion) , 是将外源 DNA 注入到 子房中轴的胎座位置, 经形成的花粉管胚囊, 转化