原代肿瘤细胞的培养
肿瘤细胞原代培养及药敏_MTT法_的质量控制
肿瘤细胞原代培养及药敏(MTT法)的质量控制徐文科1,乔小云2(1.安徽省皖南医学院弋矶山医院,安徽芜湖241001;2.江苏省南京市鼓楼医院,江苏南京210008)摘要:目的考察肿瘤细胞原代培养及药敏(MTT法)各项操作规程,为质量控制提供实践依据。
方法在操作过程中,注意强化无菌操作、规范化取舍标本、显微镜下控制单细胞悬液浓度、培养和测定条件的控制、工作液稳定性的研究。
结果肿瘤细胞原代培养及药敏(M TT法)的结果稳定性有了很大的提高。
结论通过严格控制实验操作程序,肿瘤药敏M TT 法的临床相符性令人满意,可在实际工作中推广。
关键词:肿瘤细胞;培养;药敏;质量控制肿瘤细胞培养和药敏实验是筛选抗肿瘤药物的主要研究方法[1,2]。
不合适的临床抗肿瘤化疗药物不仅使治疗失败,同时能诱导肿瘤细胞产生耐药性。
因此,对提高临床疗效、减轻毒副作用也具有重要的意义[3]。
目前国内的医疗机构中,对肿瘤组织进行细胞培养及药敏实验大多采用体外四氮唑盐(M TT)法,具有操作简便、成本低廉、耗时少、无放射性等优点[4~6]。
该法主要的缺陷是,结果不稳定导致与临床相符性差。
究其原因,因为在整个操作过程中,需要严格质量控制的步骤较多,各种操作过程需要多次试验来验证[7,8]。
我们在实际工作中,通过流程质量控制,获得了比较满意的结果。
现报道如下。
1操作规范化1.1强化无菌操作在细胞培养及药敏实验时,需要配制1640培养液、工作浓度的试剂和抗肿瘤药物、含有抗生素的生理盐水等。
这些药液的配制要求必须在净化的空间中配制,以免有细菌的污染。
参与配制的玻璃瓶、培养皿、不锈钢细胞滤筛、试管、移液管、吸头等器械均需在清洗后121e、30 m i n水蒸汽湿热灭菌。
对微量移液系统、洗耳球等不宜湿热灭菌的物品,在实验操作前后,用75%乙醇或0.1%醋酸氯己定溶液擦拭灭菌,可以获得较好的无菌效果。
1.2病理标本的规范化取舍一般来说,在室温条件下,组织细胞离体2h,后,活性受影响。
肿瘤细胞培养技术
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
增生、吞噬碎片；第4~5天可见小堆 杂交瘤细胞生长。记录。 2. 融合后5~7天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出0.1ml ~ 0.15ml HAT， 换成同量HT培基。
单克隆抗体制备
七. 杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状
态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂 交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免 目的杂交瘤丢失。
可溶性抗原：2~10g
细胞抗原：1 105
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。
细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
一、取材的基本要求.1．取材要注意新鲜和保鲜.2．应严格无菌.3．防止机械损伤.4．去除无用组织和避免干燥.5．应注意组织类型、分化程度、年龄等.6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材.主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。
内脏和实体瘤的取材.内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。
血液细胞的取材.血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材.严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
动物组织取材.1、鼠胚组织取材.首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
.2、幼鼠胚肾（或肺）取材.幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
肿瘤细胞原代培养
肿瘤细胞原代培养
肿瘤细胞原代培养是一种将体内肿瘤组织中的细胞分离出来，在培养基中进行繁殖和扩增的方法。
这种方法可以帮助研究人员更深入地了解肿瘤细胞的生物学特性，发现新的治疗方法和药物。
肿瘤细胞原代培养需要选择适当的细胞类型和培养条件。
通常采用的细胞类型有肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞。
培养条件包括培养基的成分、PH值、温度、氧气含量、营养物质等。
肿瘤细胞原代培养的优点是可以获得大量的肿瘤细胞，方便进行实验和研究。
同时，原代培养的肿瘤细胞更接近于体内的肿瘤细胞，更适合用于药物筛选和毒性测试。
然而，肿瘤细胞原代培养也存在一些缺点。
由于肿瘤细胞的不稳定性和异质性，有些肿瘤细胞很难在培养中生长和扩增。
此外，肿瘤细胞原代培养也容易受到外界因素的干扰，如细菌和真菌的污染、PH 值的变化等，从而影响实验结果的准确性。
因此，在进行肿瘤细胞原代培养时，需要注意细胞的选择和培养条件的控制，尽可能减少外界因素的干扰，以获得准确可靠的实验结果。
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抗肿瘤药物的体外体内模型权威验证评价
抗肿瘤药物的体外体内模型权威验证评价肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，而抗肿瘤药物的研发是治疗肿瘤的重要手段之一。
为了评估抗肿瘤药物的疗效和安全性，科学家们通常会使用体外体内模型进行验证评价。
这些模型可以模拟肿瘤细胞内的药物作用和体内的药物代谢，为药物研发提供重要的参考依据。
下面将介绍几种常用的体外体内模型，并对其权威性验证评价进行讨论。
一、细胞模型细胞模型是研究抗肿瘤药物作用机制和疗效评估的重要工具。
常见的细胞模型包括肿瘤细胞系、原代肿瘤细胞和3D细胞培养模型。
1. 肿瘤细胞系：肿瘤细胞系是从患者的肿瘤组织中分离和培养出来的细胞系。
它能够长期稳定地生长，在体外模拟肿瘤细胞的特性和药物反应。
通过测定细胞的增殖、凋亡和迁移能力，可以对抗肿瘤药物的治疗效果进行初步评估。
2. 原代肿瘤细胞：原代肿瘤细胞是从患者新鲜手术标本中分离和培养出来的细胞。
与肿瘤细胞系相比，原代肿瘤细胞更接近真实的肿瘤环境，具有更高的生物学真实性。
因此，原代肿瘤细胞模型被广泛应用于抗肿瘤药物的体外评估。
3. 3D细胞培养模型：3D细胞培养模型是一种能够模拟肿瘤组织结构和功能的模型。
它通过在细胞培养基中添加支撑基质，使细胞能够在三维空间中生长和相互作用。
这种模型更接近于真实的肿瘤微环境，能够更准确地评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用。
二、动物模型除了细胞模型外，动物模型也是评估抗肿瘤药物疗效和安全性的重要手段。
常见的动物模型包括小鼠模型、大鼠模型和人源异种移植瘤模型。
1. 小鼠模型：小鼠模型是最常用的抗肿瘤药物研发模型之一。
小鼠体内的肿瘤模型可以通过移植肿瘤细胞、异种移植瘤或基因敲除等方式得到。
通过观察肿瘤的生长抑制、体重变化和生存率等指标，可以评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用。
2. 大鼠模型：大鼠模型与小鼠模型类似，但由于其体型较大，更适合用于评估肿瘤治疗手术的效果。
大鼠模型还可以用于评估肿瘤转移和药物代谢等指标，为抗肿瘤药物的疗效评估提供更全面的信息。
原代培养
人肺的成纤维细胞1.准备2个50ml的离心管，加入20ml的1640+10%FBS+0.1%三抗。
置于冰盒内。
手术标本取距离肿瘤2cm的标记CAF；距离肿瘤大于2cm的标记NF。
取回的组织在超净台内处理。
2.用1%双抗PBS清洗组织，直至溶液清洗。
尽量去除血清及杂志。
去除血管（黑）等附属物。
3.用剪刀剪碎组织（时间5min以内），大小1mm3,加入双抗PBS,将组织吹散，静止15min,更换新的PBS，离心沉淀组织块。
4.用FBS打湿25cm2培养瓶底，吸掉多余的FBS，静置。
准备200ul 的tip剪掉尖头，用火烧弯。
200ul的tip吸取组织快，接种于培养瓶内，每瓶大约25块。
将培养瓶倒置，加入2ml的1640+10%FBS+0.1%三抗，置于培养箱中，6.除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。
注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。
7.传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 –1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。
鼠成纤维细胞的原代培养1.小鼠颈椎脱臼致死,置于75%的酒精中,转移到超净台内.2.酒精擦拭小鼠2次.镊子夹取皮肤,剪开笑口,钝性分离.剪开肿瘤块外包膜(NF)一个小口,剥离出肿瘤块放入一个培养皿中.剪掉外包膜,放入另一个培养皿中（NF）.洗涤两次.封口转移至细胞放内.3.NF培基吸走,用剪刀剪碎至0.5-1mm3CAF剪取肿瘤块的内包膜，剪碎至0.5-1mm3Ⅳ型胶原蛋白（或胰酶），4℃（或37℃）培养箱过夜。
（或者此步骤省掉）。
4.用纯的血清或者20%血清浸湿组织块。
弯头吸管（注射器）吸取组织块，培养瓶种植0.5CM间隔，15-20块/25ML培养瓶。
5.将组织块加到培养瓶壁上，竖起，培养箱中培养2-4h，直至贴壁。
加入培养基培养。
翻动培养瓶使底朝上，加入2-3ML的培养基，塞紧瓶塞，置于培养箱，2-3h,待组织贴壁。
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。
一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。
用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。
也可以考虑动物媒介培养。
根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。
具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。
二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。
三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。
新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。
近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。
但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。
众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。
另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。
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原代肿瘤细胞的培养
1、组织提取和处理
1）手术切除的标本立即置于冰壶中存放着的RPMI1640中，随后立即送往实验室。
2）将标本取出置于无菌的平皿中，使用无菌手术刀取出周边坏死组织和脂肪组织。
3）用D-Hanks溶液清洗3遍去除血迹。
4）将组织置于双抗溶液（青霉素5×105U/L，链霉素100mg/L）中，浸泡20min。
2、制备单层细胞
1）将组织切成1mm3的组织块，一组置于30ml胶原酶I（2×105U/L）的三角瓶中，封口；一组置于30ml胰蛋白酶（）的三角瓶中，封口。
2）消化：在37℃空气震荡箱中，120r/min消化（胶原酶I需3h，胰蛋白酶30min）。
3）100目细胞筛过滤，滤液1000r/min离心10min，弃上清。
4）用D-Hanks溶液清洗2遍。
5）5%小牛血清RPMI1640培养基，重悬。
6）细胞计数，109个/L 浓度接种于25ml培养瓶中培养。
其他同常规培养。