肿瘤细胞培养基本方法
人肿瘤细胞培养的原理
人肿瘤细胞培养的原理人肿瘤细胞培养是指将来自人体中的肿瘤组织或细胞分离、培养和保存的过程。
这种细胞培养技术不仅在医学研究领域具有重要意义，也被广泛地应用于药物筛选、毒性测试及疾病模型的构建等领域。
人肿瘤细胞培养的原理主要包括以下几个方面：1. 肿瘤细胞的分离和培养基的选择：首先从人体肿瘤组织中获得细胞，通常采用手术、活检或穿刺等方法取得。
然后将组织样本经过切碎、消化酶处理等步骤，使其中的细胞得以分离。
根据所选细胞类型的不同，可以选择适当的培养基来维持细胞的生长、增殖和功能维持。
常用的培养基包括DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜尔贝科修正鹰鳝培养基）、RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）、F12（Ham's F-12鹰鳝培养基）等。
2. 细胞的传代：肿瘤细胞培养的过程中，细胞会经过一系列的传代过程。
一般情况下，初始细胞数较少的细胞会在培养基中进行扩增，达到一定的细胞数量后，需要进行传代。
传代是将已经增殖的细胞在一个新的培养器中继续培养的过程。
传代过程需要注意，细胞的数目、培养基的成分和细胞培养器的选择等因素都会影响细胞的传代效果。
3. 培养条件的优化：为了使肿瘤细胞在体外更好地生长和繁殖，需要优化培养条件。
这包括培养基的配方、温度、pH值、气体组成等因素的调整。
培养基中通常会添加适当的营养物质，如氨基酸、脂类、维生素和微量元素等，以满足细胞的生长需求。
同时，细胞培养过程中需要保持适当的温度和湿度，通常将温度维持在37，湿度维持在95％以上。
还需要提供合适的气体环境，如5％CO2 /空气混合体，以维持细胞生长所需要的适宜pH值。
4. 检测细胞的纯度和活力：细胞培养过程中，需要定期检测细胞的纯度和活力。
细胞的纯度是指细胞中肿瘤细胞的比例，可以通过免疫细胞化学、流式细胞术等方法进行检测。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
肿瘤细胞培养技术
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
增生、吞噬碎片；第4~5天可见小堆 杂交瘤细胞生长。记录。 2. 融合后5~7天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出0.1ml ~ 0.15ml HAT， 换成同量HT培基。
单克隆抗体制备
七. 杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状
态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂 交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免 目的杂交瘤丢失。
可溶性抗原：2~10g
细胞抗原：1 105
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1、取材：
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。
取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。
2、培养基：
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMII640. DMEM s Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine )性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。
按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤
细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。
但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。
有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。
总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
肿瘤细胞培养基本方法
肿瘤细胞培养基本方法(一)准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。
在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。
用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。
培养基品牌货号D-MEM/F-12 GIBCO 12400024GIBCO 12800017 Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (highglucose)F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder GIBCO 21700075Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder GIBCO 12200036Leibovitz's L-15 Medium powder GIBCO 41300039McCOY's 5A SIGMA M4892Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powderGIBCO 11900024 (MEMα)with ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO 12000022 Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder(MEMα)without ribonucleosides and deoxyribonucleosidesMinimum Essential Medium (MEM) powder GIBCO 41500034NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'SSIGMA N3520 MODIFICATION (F12K)RPMI Medium 1640 GIBCO 31800022EGF SIGMA E9644Sodium pyruvate SIGMA P2256-25GSIGMA M5017 MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS ANDL-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONA TE.CELL CULTURE TESTED2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
ctc培养方法
ctc培养方法CTC培养方法CTC（循环肿瘤细胞）是指从肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中检测到的脱落的肿瘤细胞。
CTC的检测和分离是目前肿瘤临床诊断和治疗中的热点研究方向之一。
下面将介绍一种常用的CTC培养方法。
一、细胞准备在进行CTC培养之前，需要从肿瘤患者的外周血中分离出CTC。
首先，采集患者的外周血样本，并利用血液分离管或密度梯度离心法将血液分离为上清液和红细胞沉淀。
然后，使用CTC捕获技术，如磁珠捕获、细胞过滤或微流控芯片等方法，将CTC从上清液中富集出来。
最后，使用显微镜或流式细胞术确认CTC的存在并计数。
二、细胞培养基准备为了成功培养CTC，需要准备适用的细胞培养基。
常用的细胞培养基包括DMEM、RPMI-1640等。
在培养基中加入适当浓度的胎牛血清、抗生素和生长因子，以提供细胞所需的营养物质和生长环境。
三、细胞培养条件将分离出的CTC转移到预先准备好的细胞培养基中。
将细胞培养皿置于恒温培养箱中，保持适宜的温度（通常为37℃）。
此外，还需提供适当的CO2气体环境以维持细胞的酸碱平衡。
四、细胞培养监测在CTC培养的过程中，需要定期观察和监测细胞的生长情况。
使用显微镜观察细胞的形态和数量，并记录相关数据。
此外，还可以通过免疫组化染色、蛋白质检测等方法，对CTC的特征和功能进行进一步分析。
五、细胞培养维持为了维持CTC的生长和增殖，需要定期更换培养基，以提供新鲜的营养物质。
同时，还需注意细胞密度的控制，避免细胞过度生长或过度稀释。
此外，还需注意细胞的传代问题，及时进行细胞的传代以保持CTC的活性和稳定性。
六、细胞培养应用通过CTC的培养，可以进一步研究肿瘤细胞的生物学特性、耐药机制和转移能力等。
此外，还可以利用培养的CTC进行药物敏感性测试，评估不同药物对肿瘤细胞的作用效果，为个体化治疗提供参考依据。
CTC培养是一种重要的肿瘤研究方法，通过适当的细胞准备、细胞培养基准备和培养条件控制，可以成功培养出CTC，并利用其进行肿瘤研究和个体化治疗的相关应用。
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肿瘤细胞培养基本方法
(一)准备和安装过滤器
清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。
在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。
用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。
2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
3、调pH至7.2左右。
4、加水至最终体积。
5、在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。
6、瓶口封好，4℃冰箱贮存。
(三)小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近
来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。
胎牛血清不必灭活。
1、将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
2、处理后的血清贮存于4℃。
3、小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。
(四)生长培养基的配制
除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
1.培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。
2.按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。
按1％体积
分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。
(五)冻存细胞的复苏
1.应遵守慢冻快融的原则。
先将水浴锅调至37-37。
5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸
至水面以下不断摇动至融化。
2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取
出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。
(六)传代:
1.贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。
50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使
细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。
2.悬浮细胞:
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。
(七)冻存
将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约
106/ml。
加入10%的DMSO。
以每管1～2ml分装至冻存管中。
用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。
次日保存到液氮中。
(八)注意事项
1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;
2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;
3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管
或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。
分装后置4度保存;
4.消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度
保存;
5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌
的应按程序来菌)。
至少每月一次。
6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。
手
及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。
用完后同样操作。
整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。