抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抗肿瘤药物筛选方法及体内药效学评价体系
抗肿瘤药物筛选方法及体内药效学评价体系引言：肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，对其进行系统研究和筛选出有效的抗肿瘤药物至关重要。
本文将介绍抗肿瘤药物筛选方法和体内药效学评价体系，以期加强抗肿瘤药物的研发和应用。
一、抗肿瘤药物筛选方法1.高通量筛选平台（HTS）：利用微孔板和机器人技术，大规模、高效地筛选化合物或草药中的抗肿瘤活性物质。
通过测定细胞增殖、细胞周期、转移能力和凋亡等参数，筛选出具有抗肿瘤活性的化合物。
2.化学方法与计算机辅助筛选：利用化学合成技术，设计和合成一系列的化合物，通过计算机模拟和数据库筛选，选出具有潜在抗肿瘤活性的化合物。
3.多维数据整合筛选方法：采用多个筛选指标，综合多种方法对候选化合物进行研究和评价。
如细胞毒性数据、抗肿瘤活性数据、药代动力学参数等，加强对候选化合物的筛选和评价。
1.细胞系体内实验：将候选化合物通过体外培养的肿瘤细胞系，进行细胞毒性和细胞凋亡等实验，评估化合物的抗肿瘤活性。
2.小鼠移植瘤体内实验：将人体肿瘤移植到小鼠体内，观察化合物对肿瘤生长和转移的影响，评价化合物的抗肿瘤活性。
3.药物代谢动力学研究：通过给小鼠或大鼠静脉或口服投给候选化合物，进行药物代谢动力学研究，包括体内分布、代谢和排泄等过程，从而了解化合物在体内的代谢和消除。
4.药物安全性评价：通过给小鼠、大鼠或犬等动物进行长期或短期的给药实验，观察化合物对动物的毒性反应和安全性，评价化合物的毒性作用。
5.疗效评价体系：根据体内实验结果，评估化合物对肿瘤的疗效，包括肿瘤体积、肿瘤抑制率、生存期延长等指标。
结论：抗肿瘤药物的筛选和评价是抗肿瘤药物研发过程中的重要环节。
高通量筛选平台、化学方法与计算机辅助筛选和多维数据整合筛选方法是目前常用的药物筛选方法。
体内药效学评价体系则包括细胞系体内实验、小鼠移植瘤体内实验、药物代谢动力学研究、药物安全性评价和疗效评价。
通过这些方法和体系，可以筛选出活性强、毒副作用小、疗效好的抗肿瘤药物，为临床治疗提供有力支持。
抗肿瘤药物的筛选方法
2）细胞传代
贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化 1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养 液中。
3）细胞计数
细胞计数板
5）细胞接种
3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁 24小时，或对数生长期
6）加药处理72 h（指定时间点） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小时 8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的
方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取ＤＮＡ，上
凝胶电泳，ＥＢ染色后，ＵＶ灯下观察。
结果：凋亡细胞显示ＤＮＡ梯带。
CTL DRUG1 DRUG2 MARKER
３）PI/Annexin-Ｖ-FITC双染色分析
原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞
表面，PS结合标记荧光素FITC的Annexin-V 但细胞膜仍然完整，荧光染料ＰＩ不能进 入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V 和PI的双标记。
结果处理：同ＭＴＴ法
Ｃ）细胞排染法（酞酚蓝） 原理：
细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正 常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。
伊红、苯胺黑 等染料
方法：
细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板， 分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）
结果：
细胞死亡率= 对照组活细胞数－给药组活细胞数
（%）
方法：肿瘤细胞同时加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，
用流式细胞仪分析。
PI
正常细胞
Annexin-V (-)
PI
(-)
晚期凋亡细胞
Annexin-V (+)
PI
(+)
早期凋亡细胞
Annexin-V (+)
mTOR抑制剂的筛选方法
mTOR抑制剂的筛选方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。
mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。
人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。
近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。
本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。
【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。
1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。
mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。
mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。
1.mTOR的分子结构mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。
mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。
这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。
mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催化域相似。
蛋白激酶域的上游是FRB域，为FKBPl2一雷帕霉素复合物与mTOR相互作用的区域，该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用。
FRB 下游大约500个氨基酸残基处为FAT域，作用可能是与mTOR分子末端的FATC域形成一个空间结构，从而暴露mTOR分子的催化域。
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法09级生科3班余振洋200900140156一、【实验原理】1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物：恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。
多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。
寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。
世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。
8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。
即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。
这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。
鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。
这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。
2．关于筛选方法：下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。
1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。
抗肿瘤药物的筛选方法
抗肿瘤药物的筛选方法1.细胞毒性筛选：通过使用细胞系或动物模型，评估候选药物对肿瘤细胞的毒性效应。
这些细胞系通常来自于肿瘤组织或细胞株库。
可以使用MTT试剂或其他细胞代谢活性测定方法来评估药物对细胞生存能力的影响。
2. 细胞增殖和凋亡分析：通过评估候选药物对肿瘤细胞增殖的影响，可以确定其抗肿瘤效应。
此外，还可以使用凋亡标记物如Annexin V和Casapese-3评估候选药物对肿瘤细胞的凋亡诱导效应。
3.细胞周期分析：肿瘤细胞与正常细胞相比，在细胞周期的控制上存在差异。
通过评估候选药物对肿瘤细胞周期的影响，可以确定其抗肿瘤机制。
流式细胞仪是一种用于进行细胞周期分析的常见工具。
4. 迁移和侵袭分析：肿瘤侵袭和迁移是肿瘤生长和转移的重要步骤。
通过使用Boyden室和Transwell孔板，可以评估候选药物对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制效果。
5.血管生成抑制分析：肿瘤生长和转移需要新的血管生成。
通过评估候选药物对血管生成的抑制效果，可以确定其抗肿瘤机制。
常见的评估方法包括管状结构形成、血管内皮细胞迁移和血管内皮细胞增殖等。
6.体内动物模型：通过使用小鼠或其他动物模型，评估候选药物对体内肿瘤生长和转移的影响。
这些模型可以是异种移植肿瘤模型、转基因肿瘤模型或者荷瘤小鼠模型等。
7.药代动力学和安全性评估：候选药物需要进行药代动力学和毒理学评估，以确定其在体内的药物代谢、分布和排泄情况，以及其对正常细胞和组织的安全性。
8.临床试验：在药物筛选的最后阶段，候选药物需要进行临床试验，以评估其对人体肿瘤的疗效和安全性。
这些试验通常分为三个阶段：I期试验用于评估药物的安全性和耐受性，II期试验用于评估药物的有效性和适应症，III期试验用于验证药物的疗效和安全性，并与标准治疗进行比较。
总体而言，抗肿瘤药物的筛选方法是一个复杂的过程，需要通过多种实验评估和临床试验来确定候选药物的疗效和安全性。
这些方法可以帮助研究人员在众多候选药物中筛选出最有潜力的抗肿瘤药物，为肿瘤患者的临床治疗提供更有效和安全的选择。
抗肿瘤药物筛选问题分析
抗肿瘤药物筛选问题分析1 动物移植性肿瘤实验法1.1 概况:迄今为止，动物移植性肿瘤实验法仍是最通用的方法。
现有移植性肿瘤接种成功率高达100%，可在同一时间内获得大量（几十至数百只或更多）生长相对均匀的肿瘤，以供实验所需。
动物多选用小鼠，偶亦见大鼠和地鼠，均雌雄皆可，但每批实验只用一个性别;一般给药7～14d，在第8～15天可解剖动物获得结果。
该方法可以判断在动物耐受剂量下，药物是否有明显抑制肿瘤生长的作用，这是任何体外试验不能代替的，其结果可作为判别抗癌药物临床疗效的有意义的根据。
药物抗肿瘤筛选时，最好采用3种瘤株，即肉瘤、腹水性肿瘤和白血病株，国内常采用S180、艾氏癌腹水型和小鼠白血病株。
然而，一种药物未必对各种类型的动物移植性肿瘤都有效，选择单一瘤株来筛选可能漏筛药物，特别是动物肿瘤的生物学特点与人的有较大差距时，假阴性的可能性更大。
因为动物瘤株恶性程度高，生长迅速，对药物的敏感性比人类自发的癌瘤高得多，因此认为本法的命中率低。
美国国立癌症研究所（NCI）为了要寻找对人癌特定细胞有效的药物，采用人癌（主要是肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等）细胞株经体外试验法初步筛选有效的药物，然后将人癌细胞接种到T细胞免疫缺陷的裸小鼠或免疫抑制小鼠造模，以确证药物对人癌的作用。
我国对新药在以上第一轮筛选有效的基础上，也推荐人癌细胞异种移植模型进行第二轮筛选。
1.2 瘤株选择:目前临床上常用的抗肿瘤药大多首先经动物移植性肿瘤筛选而发现的，从寻找新药角度看来，按照我国目前条件和情况，筛选细胞毒类药物可选用肉瘤S180实体性、艾氏癌腹水型（EAC）、肝癌Hep腹水型（HAC）或实体型（H22）、Lewis肺癌LL、白血病P388或L1210、黑色素瘤B16、肉瘤S37、肠癌C38、C26及瓦克癌肉瘤W256等。
1.3 疗效评价1.3.1 实体瘤:天然药抑制率大于30%，化学药大于40%，且经统计学处理有显著差异时，认为有苗头，需继续重复，连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。
MTT原理及实验心得
MTT法原理：活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyiterazolium bromide,MTT]为篮紫色的不溶于水的甲瓉（formazan）,甲瓉的多少可通过酶标仪测定其在490nm处的OD值而得知。
因为甲瓉生成量在通常情况下与活细胞数成正比，因此可以通过OD值推测活细胞数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。
其原理是很清楚，但是我是做的海洋微生物抗肿瘤药物筛选，将发酵液作为筛选对象，有抗肿瘤活性的继续做，但是我做了很多样本，用SGC7901肿瘤细胞做筛选，结果用MTT法检测，得到抑制率都是负的％二百多，也就是好像有促进肿瘤细胞生长作用，我不知道为什么？是不是用MTT法检测有什么弊端，请各位大侠讨论一下。
1、可能你的药物有颜色，可以在细胞内沉积，又能被最后的溶剂溶解。
2、你的药液成份和浓度都不清楚，又不能定量，最好能够通过别的途径检测一下你的药液的主要成份和浓度。
或者能够知晓是哪类成份也有帮助。
3、MTT单次的结果可能不是很稳定，但多次结果是可信的。
4、跟操作方法有一定关系，96孔板的最外围36孔只能单加培养液，不能养细胞测OD值，只能使用中间的60孔测OD值，因有边缘效应存在。
5、可以将你的发酵液用膜过滤，分成几种不同粒径的样品，分别冻干，用培养基溶解。
我做过一些蛋白的抗肿瘤筛选，有的蛋白有明显促肿瘤增殖作用。
有的多糖也有促肿瘤生长作用。
所以我认为最关键的是样品的处理问题。
MTT法的操作要比较仔细，测定的细胞抑制率和IC50是可以重复的。
1.我的样品是发酵液，不会有染色，而且是在吸出培养液后在加入新鲜的培养液再加MTT的，所以药物的影响基本可以排除。
2.我的粗发酵液，只是粗筛，没办法弄出它是什么成分，如果弄出成分啦，我就毕业啦。
3.边缘效应不会有，在吸出培养液后在加入新鲜的培养液再加MTT的，所以边缘效应可以排除。
抗肿瘤药物的药效评价方法
抗肿瘤药物的药效评价方法肿瘤是世界上常见的疾病，给人类生命的健康和幸福造成极大的威胁。
一些抗肿瘤药物的出现为肿瘤治疗开辟了新的方式，而这些药物的药效评价方法也显得尤为重要。
因为药效评价不仅关乎药物的疗效，同时也关系到肿瘤患者的生存质量和生命安全。
1. 细胞毒性实验细胞毒性实验是慢性毒性检测的方法之一，其原理是在体外培养的细胞系中检测药物的毒性和抗肿瘤效果。
通过这种方法，可以评估药物对不同细胞系的杀伤能力，筛选出在不同肿瘤细胞系中具有较高活性的化合物，寻找到能够选择性杀伤肿瘤细胞的药物。
2. 体外溶瘤实验体外溶瘤实验是评估药物在体外可溶性肿瘤抗原反应能力的实验。
其主要原理是，将一定浓度的药物加入到溶瘤液中，再将溶瘤液加入到肿瘤细胞中，观察减少的溶瘤液溶解率并计算药物的溶化指数，从而评估药物的溶瘤能力。
3. 细胞增殖抑制法通过细胞增殖抑制法，可以评价药物对不同类型肿瘤细胞的增殖能力。
这种方法基于细胞增殖动力学，利用细胞数量来评估药物的抑癌活性。
4. 动物实验动物实验作为临床前药效评估的一种标准方法，可以评价药物的抗肿瘤效果及其毒副作用。
通过对动物实验的设计，结合肿瘤模型的种类和药物治疗的方案，进行对药物筛选和疗效评价。
5. 临床前药效评价临床前药效评价类似于动物实验，但其更注重药物在人体内的生物活性评估，可包括药物体内代谢规律、药物与配体结合与作用、药物毒效关系等。
其中分子靶点技术、蛋白色谱技术、DNA微阵列技术和基因组学和蛋白质组学等技术被广泛应用于临床前药效评价。
总而言之，药效评价方法是多样的，它们可以互补，并在不同的研究阶段中使用。
不同的实验方法需要具备不同的技术和实验条件，因而评价细致、准确、可重复性和可比性高的抗肿瘤药物是一个复杂且具有挑战性的过程。
需要依据实验的目的和要求，结合不同类型肿瘤的特点，综合运用各种评价方法，才能更好的评价抗肿瘤药物的药效，为临床上有效治疗提供支持和保障。
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抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法09级生科3班余振洋200900140156一、【实验原理】1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物：恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。
多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。
寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。
世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。
8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。
即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。
这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。
鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。
这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。
2．关于筛选方法：下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。
1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。
已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。
因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。
2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。
或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。
现在普遍采用一种特殊的荧光染FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA水解释放出具有强烈荧光的荧光素。
死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏，FDA水解水平大大降低，这样通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而测定出药物对细胞的作用，推测其抗肿瘤的效果。
3）应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物结晶紫染色测定法是由Gillies等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。
其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。
而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值(OD)，就可测定活细胞的数量。
近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高、重现性好的特点。
4）应用噬菌体筛选抗肿瘤药物已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA复制分裂并传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变¨。
有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放出完整的噬菌体，致使敏感的细菌感染裂解，这种作用称为诱导作用。
有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用，因此在研究肿瘤病毒一肿瘤细胞间关系时，常与溶原性噬菌体一溶原性细菌模型相比拟，同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物，并且已经取得一定成效。
5）细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论，天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低受到国内外的广泛关注。
近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视，因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。
经过长时间的摸索，除以上所述的几种方法外，对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法，现在一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，用MTT实验、软琼脂等方法，在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用，筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。
在此基础上，以荷瘤小鼠为实验模型，在动物水平检测其在体抑瘤作用。
二、【试验方法】1. 以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物——端粒重复扩增法1）端粒酶产物的扩增取细胞酶提取液1 L分别加人TS引物0．36p,mol／L，dNTP501xmol，TaqDNA 多聚酶1 IU，CX引物0．28Ixmol／L，Mg¨ 1．5 mmol，在251xL反应液中进行PCR 扩增。
扩增程序为在3O℃反应30 min，72~C30 S，然后在94℃变性30 S，55℃退火30s，72℃延伸30 S，进行3O个循环。
2）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物用12％丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025微升加人加样孔，以180V 的电压进行电泳2h左右。
3）银染显色用1O％乙醇和0．5％冰醋酸固定聚丙烯凝胶35 min，然后加人硝酸银溶液(最终浓度为0．2％)，在37℃水浴上振荡染5 min，用超纯水洗涤三次。
再加人显色液(30％的NaOH和0．1％的甲醛)振荡直至DNA条带出现，一般为20 min。
最后将显色凝胶移至固定液中固定5 min。
普通光源照像。
4）结果判断由于端粒是由短DNA重复序列组成，而端粒酶的作用是维持端粒末端的长度，因此可以用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性。
即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带，则判断端粒酶的活性依然存在为阳性。
恶性肿瘤治疗的理想靶点应该是寻找到一种对肿瘤细胞生长所必须，但又不存在于正常细胞的物质。
端粒酶就是一种在许多肿瘤组织中处于高表达活性，而在正常组织中却没有酶活性表达的特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。
它在维持肿瘤细胞的高度增殖时，对端粒的缩短起着重要的作用，从而提示端粒酶可能是恶性肿瘤组织的一个标志。
2．应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物1）细胞培养该实验采用体外培养的不同种肿瘤细胞系，经0．25％胰酶加0．02％ EDTA 消化后吹打，600—800rpm离心，稀释至细胞浓度为5×10 +／mE。
每组3—4个平行孔，接种在微孔培养板中，对照组只加细胞不加药物。
37℃5％CO，条件下培养。
2）药物敏感性实验常规传代细胞待贴壁后，每孔加药，使药液终浓度为0．1ug／mL，0．5ug ／mL，1ug／mL，5ug／mL，10ug／mL，放人培养箱中培养至最佳作用时间。
3）荧光素测定培养至最佳作用时间的细胞移去培养液，用PBS缓冲液冲洗两遍，准确加入1．8mlM~LPBS缓冲液，随后加入200ulM~L含FDA的DMSO储备液(100ug／mL)，使其终浓度为10ug／mL，摇匀后，37~C5％CO 条件下培养1h，用荧光分光光度仪RF 一540在激发光波长为485nm，发散光波长为538nm，狭缝为2nm，衰减为5(×16)的条件下测定每孔溶液的荧光强度值。
荧光素测定法具有快速、灵敏、准确性高、重现性好的特点，其细胞测定范围宽、线性好，适用于大量抗肿瘤药物的筛选和临床抗肿瘤药物的预试。
3．应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物——结晶紫染色法1）细胞培养实验采用体外培养细胞系，经0．25％胰酶加0．02％EDTA消化后吹打，600—800 rpm离心，稀释至细胞浓度为5×10 爪／mL。
每组4个平行孔，接种在微孔培养板上。
空白孔只加营养液不加细胞，对照孔只加细胞不加药物。
37℃ 5％CO 条件下培养。
2）药物敏感性实验常规传代细胞待贴壁后，每孔加药液，使药液终浓度为0．1 g／mL，0．5 ／mL，1 g／mL，5 g／mL，10 ／mL等。
放人培养箱培养至最佳作用时间。
3）结晶紫染色测定至最佳作用时间的细胞用11％的戊二醛固定，摇20min，使细胞停止生长，达到实验结果的均一性。
固定后的细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。
37~C烘干。
加入0．1％的结晶紫液对细胞染色。
振摇30min，用蒸馏水洗涤，至剩余的结晶紫液冲洗干净。
37~C烘干。
加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取，1 h后在波长为595nm处测定。
结晶紫染色测定法具有快速、灵敏、准确性高、重现性好的特点，是一种较好的抗肿瘤药物的筛选方法。
4．应用噬菌体筛选抗肿瘤药物——双层琼脂平板～纸片法1)用pH7．4之2％固体琼脂倾注于平皿底部，厚为2mm，凝固后待用。
2)取100ml pH7．4之0．7％半固体营养琼脂，溶化后冷却至50~C，加入培养18h 并已稀释l0 之金色葡萄球菌75培养液4mL及培养18h未稀释之金色葡萄球菌47培养液4mL，混匀后，倾人平板上层，厚约1mm。
3)上层琼脂凝固后，用6mm直径之无菌圆形滤纸片1片，沾取待筛药物浸膏贴于平板上，另以争光霉素为阳性对照，于37℃中培养。
4)24h后观察结果，阳性结果：溶原性细菌释放多量成熟的嗜菌体，侵入指示菌体内繁殖，而使指示菌裂解，在滤纸片周围出现密集之噬斑。
阴性结果：滤纸片周围与背景相同。
通过实验证明，具有诱导噬菌体作用的药物大多具有抗肿瘤作用，且用噬菌体一细菌间特性建立的筛选模型具有简便、迅速、适宜大量药品筛选的特点，可以广泛应用于抗肿瘤药物的筛选。
5．1细胞水平的筛选1)MTT法。
细胞培养：肿瘤细胞用含10％热灭活的小牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5％CO2及饱和湿度下培养。
药物处理：将中药单体或提取物分别溶于DMSO，作用于培养细胞体系。
药物浓度在0．005至0．5(mg／mL)之间，等量DMSO作为阴性对照。
培养体系中溶剂浓度不超过l％。
培养24h后，显微镜下观察细胞状态。
体外药物敏感性分析：针对药物单体，以几种肿瘤细胞系为实验模型，以MTT实验法分析其体外抗肿瘤活性。