抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抗肿瘤药物筛选方法及体内药效学评价体系
抗肿瘤药物筛选方法及体内药效学评价体系引言：肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，对其进行系统研究和筛选出有效的抗肿瘤药物至关重要。
本文将介绍抗肿瘤药物筛选方法和体内药效学评价体系，以期加强抗肿瘤药物的研发和应用。
一、抗肿瘤药物筛选方法1.高通量筛选平台（HTS）：利用微孔板和机器人技术，大规模、高效地筛选化合物或草药中的抗肿瘤活性物质。
通过测定细胞增殖、细胞周期、转移能力和凋亡等参数，筛选出具有抗肿瘤活性的化合物。
2.化学方法与计算机辅助筛选：利用化学合成技术，设计和合成一系列的化合物，通过计算机模拟和数据库筛选，选出具有潜在抗肿瘤活性的化合物。
3.多维数据整合筛选方法：采用多个筛选指标，综合多种方法对候选化合物进行研究和评价。
如细胞毒性数据、抗肿瘤活性数据、药代动力学参数等，加强对候选化合物的筛选和评价。
1.细胞系体内实验：将候选化合物通过体外培养的肿瘤细胞系，进行细胞毒性和细胞凋亡等实验，评估化合物的抗肿瘤活性。
2.小鼠移植瘤体内实验：将人体肿瘤移植到小鼠体内，观察化合物对肿瘤生长和转移的影响，评价化合物的抗肿瘤活性。
3.药物代谢动力学研究：通过给小鼠或大鼠静脉或口服投给候选化合物，进行药物代谢动力学研究，包括体内分布、代谢和排泄等过程，从而了解化合物在体内的代谢和消除。
4.药物安全性评价：通过给小鼠、大鼠或犬等动物进行长期或短期的给药实验，观察化合物对动物的毒性反应和安全性，评价化合物的毒性作用。
5.疗效评价体系：根据体内实验结果，评估化合物对肿瘤的疗效，包括肿瘤体积、肿瘤抑制率、生存期延长等指标。
结论：抗肿瘤药物的筛选和评价是抗肿瘤药物研发过程中的重要环节。
高通量筛选平台、化学方法与计算机辅助筛选和多维数据整合筛选方法是目前常用的药物筛选方法。
体内药效学评价体系则包括细胞系体内实验、小鼠移植瘤体内实验、药物代谢动力学研究、药物安全性评价和疗效评价。
通过这些方法和体系，可以筛选出活性强、毒副作用小、疗效好的抗肿瘤药物，为临床治疗提供有力支持。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告细胞增殖实验是研究肿瘤细胞增殖和药物筛选的重要手段。
目前常见的肿瘤细胞增殖实验包括MTT法、SRB法、CCK-8法和细胞计数法。
本综述将介绍常用的MTT法和SRB法。
一、MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖和细胞存活率的方法。
其原理是MTT剂通过被细胞还原，形成紫色沉淀，而细胞活性越强，则代谢产物越多，MTT的还原能力也越强，所以其颜色越深。
MTT法的步骤如下：1. 细胞接种：将待检测的细胞分离并接种到96孔板中，对照组和实验组各重复3次，每孔加入100 μl的细胞悬液。
2. 细胞培养：将孔板置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24h，待细胞贴附后进入下一步。
3. 加入MTT：将MTT溶液加入孔板中，加入的量为100 μl/孔，最终浓度为0.5mg/ml。
4. 离心：孔板离心5min，去除上清，加入150 μl的DMSO，进行溶解。
5. 检测：将各孔450 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
MTT法适用于多种肿瘤细胞，操作简便，可用于初筛药物的活性。
然而，MTT法也存在局限性，如MTT还原能力受到某些实验条件影响，如细胞密度、孵育时间、细胞凋亡等，需要注意标准化操作。
二、SRB法SRB法是酸性快速比色法的缩写，它通过酸性溶液中蛋白质的沉淀和染色，反映了细胞的增殖情况。
该方法操作简单，速度快，结果信度较高。
步骤如下：3. 加入SRB：将SRB溶液加入各孔中，保持10 min。
4. 洗涤：将各孔反复洗涤至清晰。
6. 检测：将各孔570 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
SRB法比较适用于肿瘤细胞形态大而扁平的情况。
此外，SRB法还能够评价细胞的耐药性，并可用于筛选化合物对细胞增殖的抑制率，是一种较为全面的细胞增殖试验方法。
三、结论以上两种实验方法在检测肿瘤细胞增殖及药物筛选中具有重要的应用价值。
在操作上，需要严格地控制实验条件，确保数据的准确性和可靠性。
基于STAT3和NF-κB双信号抗肿瘤药物高通量筛选平台的建立及应用
基于STAT3和NF-κB双信号抗肿瘤药物高通量筛选平台的建立及应用基于STAT3和NF-κB双信号抗肿瘤药物高通量筛选平台的建立及应用摘要：肿瘤是当前全球最具威胁性的疾病之一，寻找新的抗肿瘤药物一直是科学家们的研究热点之一。
STAT3和NF-κB 信号通路在肿瘤中起着关键作用，针对这两个信号通路的药物筛选具有重要意义。
本研究旨在建立一种基于STAT3和NF-κB双信号的抗肿瘤药物高通量筛选平台，并对其应用进行探索。
一、引言肿瘤的发生和发展与细胞的异常增殖和凋亡紊乱密切相关。
STAT3和NF-κB信号通路是细胞增殖和凋亡的关键调控因子，因此抑制STAT3和NF-κB信号通路成为抗肿瘤药物研究的重要方向。
然而，目前的筛选方法存在许多缺陷，如低效率、费时费力等。
因此，建立一种高通量、高效率的筛选平台对加速新药研究具有重要意义。
二、方法与材料1. 细胞系：选取多种肿瘤细胞系，如肺癌、乳腺癌和结直肠癌细胞系等，作为研究对象。
2. 细胞培养：将细胞系培养在含有适当营养物质的培养基中，保持细胞正常生长。
3. 实验药物：筛选具有抑制STAT3和NF-κB信号通路活性的化合物作为实验药物。
4. Western blotting分析：采用Western blotting技术检测细胞中STAT3和NF-κB信号通路蛋白的表达水平，评估实验药物对信号通路的抑制程度。
5. 细胞增殖实验：采用MTT法检测细胞存活率，并通过IC50值计算实验药物的抑制浓度。
6. 细胞凋亡实验：采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，评估实验药物对细胞凋亡的影响。
三、结果1. 药物筛选：通过高通量筛选平台，我们筛选出了一系列具有抑制STAT3和NF-κB信号通路的化合物。
2. Western blotting分析：实验结果显示，选定的化合物明显抑制了细胞中STAT3和NF-κB蛋白的表达水平。
3. 细胞增殖与凋亡实验：经过细胞增殖和凋亡实验，我们确定了一些具有良好抑制活性的化合物，并计算出了它们的IC50值。
抗肿瘤药物的筛选方法
2）细胞传代
贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化 1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养 液中。
3）细胞计数
细胞计数板
5）细胞接种
3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁 24小时，或对数生长期
6）加药处理72 h（指定时间点） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小时 8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的
方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取ＤＮＡ，上
凝胶电泳，ＥＢ染色后，ＵＶ灯下观察。
结果：凋亡细胞显示ＤＮＡ梯带。
CTL DRUG1 DRUG2 MARKER
３）PI/Annexin-Ｖ-FITC双染色分析
原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞
表面，PS结合标记荧光素FITC的Annexin-V 但细胞膜仍然完整，荧光染料ＰＩ不能进 入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V 和PI的双标记。
结果处理：同ＭＴＴ法
Ｃ）细胞排染法（酞酚蓝） 原理：
细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正 常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。
伊红、苯胺黑 等染料
方法：
细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板， 分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）
结果：
细胞死亡率= 对照组活细胞数－给药组活细胞数
（%）
方法：肿瘤细胞同时加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，
用流式细胞仪分析。
PI
正常细胞
Annexin-V (-)
PI
(-)
晚期凋亡细胞
Annexin-V (+)
PI
(+)
早期凋亡细胞
Annexin-V (+)
mTOR抑制剂的筛选方法
mTOR抑制剂的筛选方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。
mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。
人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。
近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。
本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。
【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。
1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。
mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。
mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。
1.mTOR的分子结构mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。
mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。
这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。
mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催化域相似。
蛋白激酶域的上游是FRB域，为FKBPl2一雷帕霉素复合物与mTOR相互作用的区域，该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用。
FRB 下游大约500个氨基酸残基处为FAT域，作用可能是与mTOR分子末端的FATC域形成一个空间结构，从而暴露mTOR分子的催化域。
抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述：抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物,作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等.本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容,其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。
旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面,通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。
本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识.具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上,根据药物的自身特点制订研究方案。
研究目的：建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究.①有效性研究抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等,为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。
②安全性评价安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考.研究计划:(a)小鼠急性毒性测试按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠,通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50)，参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。
（b）小鼠体内抗肿瘤活性测试根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。
(c）专利保护范围内的化合物的继续合成申请保护范围较大的专利,合成部分可能具有良好活性的新的化合物,拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。
《2024年小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》范文
《小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》篇一一、引言细胞增殖抑制率是评估药物或化合物对细胞生长影响的重要指标，常用于药物筛选、疾病治疗及机理研究等领域。
MTT法（四唑盐比色法）是一种常用的细胞增殖检测方法，其结果可直观反映细胞活性及增殖状态。
其中，IC50（半数抑制浓度）作为评估药物效果的重要参数，其计算方法至关重要。
本文将针对在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法进行小议。
二、MTT法与细胞增殖抑制率MTT法通过测定活细胞线粒体中脱氢酶的活性来反映细胞的增殖情况。
当细胞增殖受到抑制时，该酶的活性降低，导致MTT的还原产物减少，从而可通过比色法测定细胞活性及增殖抑制率。
因此，MTT法常用于评估药物或化合物对细胞增殖的抑制作用。
三、IC50的概念及意义IC50是指在一定条件下，药物或化合物抑制细胞增殖达到50%时所需的浓度。
IC50是评价药物效果的重要指标，可用于比较不同药物或化合物对同一细胞的抑制作用，也可用于研究药物浓度的效应关系。
四、IC50的计算方法IC50的计算方法主要有作图法和软件拟合法两种。
（一）作图法1. 将实验数据按照浓度-细胞增殖抑制率的形式整理成表，并以药物浓度为横坐标，以相应的抑制率为纵坐标，绘制剂量反应曲线图。
2. 通过绘制半对数曲线，使得抑制率在曲线中段的响应呈线性关系，根据线性回归分析求出50%抑制点对应的浓度即为IC50值。
（二）软件拟合法随着计算机技术的发展，一些专业的统计软件和生物信息软件也可用于计算IC50值。
例如：采用专门的生物统计分析软件进行数据处理和分析，如利用SigmaPlot等软件的非线性回归拟合方法求得IC50值。
此外，常用的统计软件如Excel和SPSS等也可以辅助完成此项计算。
通过拟合不同浓度药物下细胞存活率数据到某种生长抑制模型（如S型曲线模型），然后利用软件进行非线性回归分析得出IC50值。
这种方法相对更为准确和便捷。
一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法
一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法细胞共培养方法是一种常见的体外实验技术，用于研究细胞之间的相互作用、细胞生长和转化机制以及药物筛选等方面。
这里将介绍一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法。
该方法主要是通过体外培养两种或更多种细胞株，模拟细胞在体内的相互作用，进而筛选出对癌细胞有特异性杀伤作用的药物。
在该方法中，通常选用癌细胞株、正常细胞株和/或免疫细胞株，以模拟癌细胞与正常细胞之间的相互作用。
此外，还可以加入其他细胞株，如支持和调节肿瘤生长的细胞株。
这种共培养的细胞模型可以更好地模拟肿瘤微环境，从而更准确地评估抗癌药物的疗效。
以下是一种常见的细胞共培养方法的步骤：步骤1：细胞培养准备准备好癌细胞株、正常细胞株和/或免疫细胞株。
将这些细胞分别培养在适当的培养基中。
确保细胞处于活跃增殖状态，并消除培养基中的杂质和细胞死亡物质。
步骤2：混合细胞株将各种细胞株按照一定比例混合，并在适当的细胞密度下培养在共培养培养基中。
可以根据具体研究目的和需求，来选择细胞种类和混合比例。
步骤3：培养基优化根据共培养的细胞需求，优化培养基的成分和配方。
可以添加一些细胞因子、生长因子或其他营养物质，以模拟肿瘤微环境中的情况。
步骤4：共培养处理和观察将筛选药物加入共培养培养基中，并与无处理（对照组）进行比较。
在一定时间内，观察细胞生长、细胞形态的变化、凋亡率的增加等指标，以评估药物的效果。
步骤5：药物筛选和评价根据观察结果，对效果明显的药物进行筛选和评价。
可以测定药物对细胞生存率的影响，计算药物的抑制浓度（IC50），并通过其他实验手段来评估药物的抗癌活性。
这种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法的优势在于可以模拟肿瘤微环境，同时考虑到肿瘤细胞、正常细胞和免疫细胞之间的相互作用。
该方法可以提供更准确和可靠的疗效评估结果，并为抗癌药物研发提供重要参考。
当然，该方法也有一些限制，如选择合适的细胞株、优化培养条件和解释结果等方面还存在一定的挑战。
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抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法09级生科3班余振洋200900140156一、【实验原理】1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物：恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。
多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。
寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。
世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。
8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。
即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。
这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。
鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。
这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。
2．关于筛选方法：下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。
1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。
已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。
因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。
2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。
或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。
现在普遍采用一种特殊的荧光染FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA水解释放出具有强烈荧光的荧光素。
死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏，FDA水解水平大大降低，这样通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而测定出药物对细胞的作用，推测其抗肿瘤的效果。
3）应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物结晶紫染色测定法是由Gillies等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。
其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。
而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值(OD)，就可测定活细胞的数量。
近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高、重现性好的特点。
4）应用噬菌体筛选抗肿瘤药物已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA复制分裂并传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变¨。
有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放出完整的噬菌体，致使敏感的细菌感染裂解，这种作用称为诱导作用。
有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用，因此在研究肿瘤病毒一肿瘤细胞间关系时，常与溶原性噬菌体一溶原性细菌模型相比拟，同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物，并且已经取得一定成效。
5）细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论，天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低受到国内外的广泛关注。
近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视，因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。
经过长时间的摸索，除以上所述的几种方法外，对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法，现在一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，用MTT实验、软琼脂等方法，在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用，筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。
在此基础上，以荷瘤小鼠为实验模型，在动物水平检测其在体抑瘤作用。
二、【试验方法】1. 以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物——端粒重复扩增法1）端粒酶产物的扩增取细胞酶提取液1 L分别加人TS引物0．36p,mol／L，dNTP501xmol，TaqDNA 多聚酶1 IU，CX引物0．28Ixmol／L，Mg¨ 1．5 mmol，在251xL反应液中进行PCR 扩增。
扩增程序为在3O℃反应30 min，72~C30 S，然后在94℃变性30 S，55℃退火30s，72℃延伸30 S，进行3O个循环。
2）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物用12％丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025微升加人加样孔，以180V 的电压进行电泳2h左右。
3）银染显色用1O％乙醇和0．5％冰醋酸固定聚丙烯凝胶35 min，然后加人硝酸银溶液(最终浓度为0．2％)，在37℃水浴上振荡染5 min，用超纯水洗涤三次。
再加人显色液(30％的NaOH和0．1％的甲醛)振荡直至DNA条带出现，一般为20 min。
最后将显色凝胶移至固定液中固定5 min。
普通光源照像。
4）结果判断由于端粒是由短DNA重复序列组成，而端粒酶的作用是维持端粒末端的长度，因此可以用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性。
即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带，则判断端粒酶的活性依然存在为阳性。
恶性肿瘤治疗的理想靶点应该是寻找到一种对肿瘤细胞生长所必须，但又不存在于正常细胞的物质。
端粒酶就是一种在许多肿瘤组织中处于高表达活性，而在正常组织中却没有酶活性表达的特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。
它在维持肿瘤细胞的高度增殖时，对端粒的缩短起着重要的作用，从而提示端粒酶可能是恶性肿瘤组织的一个标志。
2．应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物1）细胞培养该实验采用体外培养的不同种肿瘤细胞系，经0．25％胰酶加0．02％ EDTA 消化后吹打，600—800rpm离心，稀释至细胞浓度为5×10 +／mE。
每组3—4个平行孔，接种在微孔培养板中，对照组只加细胞不加药物。
37℃5％CO，条件下培养。
2）药物敏感性实验常规传代细胞待贴壁后，每孔加药，使药液终浓度为0．1ug／mL，0．5ug ／mL，1ug／mL，5ug／mL，10ug／mL，放人培养箱中培养至最佳作用时间。
3）荧光素测定培养至最佳作用时间的细胞移去培养液，用PBS缓冲液冲洗两遍，准确加入1．8mlM~LPBS缓冲液，随后加入200ulM~L含FDA的DMSO储备液(100ug／mL)，使其终浓度为10ug／mL，摇匀后，37~C5％CO 条件下培养1h，用荧光分光光度仪RF 一540在激发光波长为485nm，发散光波长为538nm，狭缝为2nm，衰减为5(×16)的条件下测定每孔溶液的荧光强度值。
荧光素测定法具有快速、灵敏、准确性高、重现性好的特点，其细胞测定范围宽、线性好，适用于大量抗肿瘤药物的筛选和临床抗肿瘤药物的预试。
3．应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物——结晶紫染色法1）细胞培养实验采用体外培养细胞系，经0．25％胰酶加0．02％EDTA消化后吹打，600—800 rpm离心，稀释至细胞浓度为5×10 爪／mL。
每组4个平行孔，接种在微孔培养板上。
空白孔只加营养液不加细胞，对照孔只加细胞不加药物。
37℃ 5％CO 条件下培养。
2）药物敏感性实验常规传代细胞待贴壁后，每孔加药液，使药液终浓度为0．1 g／mL，0．5 ／mL，1 g／mL，5 g／mL，10 ／mL等。
放人培养箱培养至最佳作用时间。
3）结晶紫染色测定至最佳作用时间的细胞用11％的戊二醛固定，摇20min，使细胞停止生长，达到实验结果的均一性。
固定后的细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。
37~C烘干。
加入0．1％的结晶紫液对细胞染色。
振摇30min，用蒸馏水洗涤，至剩余的结晶紫液冲洗干净。
37~C烘干。
加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取，1 h后在波长为595nm处测定。
结晶紫染色测定法具有快速、灵敏、准确性高、重现性好的特点，是一种较好的抗肿瘤药物的筛选方法。
4．应用噬菌体筛选抗肿瘤药物——双层琼脂平板～纸片法1)用pH7．4之2％固体琼脂倾注于平皿底部，厚为2mm，凝固后待用。
2)取100ml pH7．4之0．7％半固体营养琼脂，溶化后冷却至50~C，加入培养18h 并已稀释l0 之金色葡萄球菌75培养液4mL及培养18h未稀释之金色葡萄球菌47培养液4mL，混匀后，倾人平板上层，厚约1mm。
3)上层琼脂凝固后，用6mm直径之无菌圆形滤纸片1片，沾取待筛药物浸膏贴于平板上，另以争光霉素为阳性对照，于37℃中培养。
4)24h后观察结果，阳性结果：溶原性细菌释放多量成熟的嗜菌体，侵入指示菌体内繁殖，而使指示菌裂解，在滤纸片周围出现密集之噬斑。
阴性结果：滤纸片周围与背景相同。
通过实验证明，具有诱导噬菌体作用的药物大多具有抗肿瘤作用，且用噬菌体一细菌间特性建立的筛选模型具有简便、迅速、适宜大量药品筛选的特点，可以广泛应用于抗肿瘤药物的筛选。
5．1细胞水平的筛选1)MTT法。
细胞培养：肿瘤细胞用含10％热灭活的小牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5％CO2及饱和湿度下培养。
药物处理：将中药单体或提取物分别溶于DMSO，作用于培养细胞体系。
药物浓度在0．005至0．5(mg／mL)之间，等量DMSO作为阴性对照。
培养体系中溶剂浓度不超过l％。
培养24h后，显微镜下观察细胞状态。
体外药物敏感性分析：针对药物单体，以几种肿瘤细胞系为实验模型，以MTT实验法分析其体外抗肿瘤活性。