骨髓瘤细胞的培养实验
细胞为骨髓瘤细胞SP20
聚乙二醇介导的细胞融合
（四）融合后混合细胞的培养
随机融合后的细胞类型
细胞类型
淋巴细胞+骨髓瘤细胞 淋巴细胞+淋巴细胞 骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤细胞
HGPRT
+ + + -
生长状态
长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
采用HAT培养液选择培养 1.换液（半量换液）2.观察
DNA，必然死亡。 B淋巴细胞在一般培养基中 不能长期生长，一般于2周内死亡。 融合的杂交瘤细胞由于淋 巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化 酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA， 克服氨基蝶呤的阻断，因此可以大 量繁殖而被筛选出来
实验材料
实验动物为纯系Balb/c小鼠，细胞为骨髓瘤细胞SP2/0; 含有一定表位的抗原； 10%DMEM培养液； HAT选择性培养基； HT选择性培养基； 融合剂为PEG2000； 兔抗鼠IgG酶标抗体； 台盼蓝溶液； 细胞培养板及常规细胞培养用试剂和器材。
（五）阳性杂交瘤细胞的克隆筛选
杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少 数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有 多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此必须进行 筛选和克隆化。 克隆化可选择的方法有液相有限稀释法、软琼脂平板法 、显微镜操作法及应用荧光激活细胞分离仪等，其中最 常用的是液相有限稀释法及软琼脂平板法。
免疫沉淀法、ELISA方法、RIA方法、免疫荧光法
McAb识别抗原表位的测定
竞争抑制试验、相加指数法、微机集群分析、免疫印迹及基因工程技术
注意事项
免疫动物的选择 免疫方案的合理制定 骨髓瘤细胞株的选择 融合剂聚乙二醇的使用 避免操作中的污染 融合后的克隆株不生长原因分析 用液氮冻存的脾细胞进行细胞融合问题
小鼠骨髓瘤细胞染色体标本的制备实验目的：实验原理：
2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液 （甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI溶 液、Giemsa染液等。
3．材料：小鼠
方法与步骤：
1.取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动 物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断 在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。
2.腹腔内注射秋水仙素3～4小时后，断头处死小鼠。 3.取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造
成骨髓细胞的流失。Fra bibliotek 4.滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等 组织清除干净。
5.加入适量低渗液，用剪刀将骨充分剪碎，并用吸管吹 打，使骨髓细胞全部释放出来。
6.用滤网将获得的液体过滤到离心管中，加低渗液至8ml 左右，室温下静置20～30分钟，进行低渗。低渗结束后， 加入1ml左右的Carnoy’s 固定液进行预固定，轻轻混匀 后，离心。
15分钟，弃去染液，水洗，镜检。
结果：
作业:
绘图表示动物染色体的典型形态。 说明在小鼠骨髓染色体的制备过程中的关键步
骤。
7. 1200转/分，离心5分钟，弃上清，加入固定液，混匀 后，室温放置30分钟，再次离心去上清，重复固定一次， 离心后，向沉淀中加入1ml预冷的固定液，将细胞重悬。
8.取洁净冰水中预冷的载玻片，稍作倾斜，用吸管吸取一 滴上述细胞悬浮液，于载玻片上方适当高度滴在载玻片 上；
9.滴片后，将片子晾干，滴加适量Giemsa染液染色10～
小鼠骨髓瘤细胞染色体标本的制备
实验目的：
掌握小鼠骨髓细胞染色体的原理和制备方法，识别小鼠染 色体的数目及特点。
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
细胞培养基本实验操作一般培养试剂介绍常用培养基及基本特性 HBSS的配制和使用攻略
常用培养基及基本特性1、RPMI-1640 MediumRPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。
主要用于悬浮细胞培养。
其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。
2、Minimum Essential Medium（MEM）也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。
成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。
MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。
3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。
适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。
4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。
低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。
5、DMEM/F12DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。
F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。
该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mM HEPES缓冲液。
6、McCoy’s 5AMcCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。
试验骨髓瘤细胞的培养
实验一、骨髓瘤细胞的培养骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640, DMEM&养基。
小牛血清的浓度一般在10〜20%,细胞的最大密度不得超106/ml, 一般扩大培养以1 ： 2稀释传代，每2〜 3天传代一次。
细胞的倍增时间为16〜20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
二材料：1.试剂：〔1〕培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM〔 Dulberco Modified Eagles Medium〕两种根底培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌〔0.22um滤膜〕，分装，4C保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100 X L.G.溶液1ml,双抗溶液1ml, 7.5% NaHCO溶液1-2ml , HEPE骆液1ml。
不完全DMEI\M养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml, NaHCO3.7g , 100X L.G. 溶液10ml，双抗溶液10ml, 7.5% NaHCO溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4 ,过滤除菌，分装4C保存。
完全RPMI-1640或DME牌养基：不完全RPMI-1640或DME牌养基80ml,灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。
〔2〕小牛血清灭活：从-20 C冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56 C30min即可充分灭活，分装小瓶〔5ml/瓶〕，-20 C冻存备用，尽量防止反复冻融。
〔3〕青、链霉素〔双抗〕溶液〔100X〕取青霉素G 〔钠盐〕100万单位和链霉素〔硫酸盐〕1g 或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶〔4-5ml/瓶〕，-20 C 冻存。
杂交瘤细胞筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
实验八细胞融合-小鼠骨髓瘤SP20细胞及小鼠脾细胞融合
一、验目的
了解细胞融合的原理 掌握细胞融合的基本方法
二、实验原理
细胞融合的概念
二、实验原理
细胞融合的概念 常用的诱导融合手段有哪些？
病毒诱导融合 聚乙二醇诱导融合 电场诱导融合 激光诱导融合
三、仪器、材料与试剂
仪器： 离心机、 CO2培养箱、超净台、 37℃恒温水浴 锅、显微镜、血球计数板、解剖器械、烧杯、载玻 片、盖玻片、离心管。 材料： SP2/0细胞、昆明小鼠 试剂： Hanks液、45%PEG ，75%乙醇
（4）细胞计数，待用。 （5）取对数生长骨髓瘤细胞， 800g 离心10分钟，取沉 淀细胞用Hanks液洗2次（每次加入5mL Hanks液，轻轻混 匀800g 离心10分钟） （6）细胞计数，待用。 （ 7 ）将骨髓瘤细胞 (105-6) 与脾细胞 (106-7) 按 1 ： 10 比例混 合在一起800g 离心10分钟，弃上清，用吸管吸净残留液 体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底， 使细胞沉淀略松动。 （每组混合两份样品) （8） 90s内加入37℃预温的1mL 45%PEG（分子量4000） 或Hanks液，边加边轻微摇动。37℃水浴90s。 （9）加37℃预温的Hanks液8mL以终止PEG作用 （10） 800g 离心10分钟，弃上清，加入1mL Hanks液， 镜检
四、实 验步骤
（1）小鼠摘眼球放血（可不做）, 拉颈 处死，浸泡在 75%酒精内，3～5min （2）无菌取脾脏， Hanks液洗一次，脾脏剪碎，培养 液洗 一次，过不锈钢筛网，转移至10mL离心管 （3）800g 离心10分钟，取沉淀细胞用Hanks液洗2次 （每次加入5mL溶液，轻轻混匀800g 离心10分钟）
画线单克隆实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握单克隆抗体制备方法。
2. 掌握单克隆抗体纯化技术。
3. 了解单克隆抗体的应用。
二、实验原理单克隆抗体（Monoclonal Antibody，MAb）是由单一B细胞克隆产生的高度特异性的抗体。
它具有特异性强、亲和力高、纯度高、稳定性好等特点，在医学、生物技术等领域具有广泛的应用。
本实验通过动物免疫、细胞融合、筛选、克隆化等步骤，制备出针对特定抗原的单克隆抗体。
三、实验材料1. 动物：小鼠（Balb/c系）2. 抗原：待检抗原3. 细胞株：小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）4. 培养基：RPMI-1640培养基、完全培养基、半量培养基5. 试剂：FCS、聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、HAT筛选培养基、抗体纯化试剂盒等6. 仪器：离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪等四、实验方法1. 动物免疫：取小鼠，按抗原免疫程序进行免疫，免疫间隔时间为2周，共免疫3次。
2. 细胞融合：将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）进行细胞融合。
3. 细胞筛选：将融合后的细胞进行HAT培养基培养，筛选出杂交瘤细胞。
4. 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 抗体检测：通过ELISA方法检测单克隆细胞的抗体活性，筛选出阳性克隆。
6. 单克隆抗体纯化：采用抗体纯化试剂盒对阳性克隆进行纯化。
五、实验结果1. 免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成功，得到杂交瘤细胞。
2. 在HAT培养基中筛选出杂交瘤细胞，克隆化培养得到单克隆细胞。
3. 通过ELISA方法检测，筛选出针对待检抗原的阳性克隆。
4. 单克隆抗体纯化成功，纯度达到90%以上。
六、实验讨论1. 本实验成功制备了针对待检抗原的单克隆抗体，为后续的抗体应用奠定了基础。
2. 在细胞融合过程中，采用适当比例的脾细胞与骨髓瘤细胞可以提高融合率。
3. 在筛选杂交瘤细胞时，HAT培养基的浓度和培养时间对筛选效果有较大影响。
淋巴细胞杂交瘤(hybridoma)单克隆抗体技术 2
淋巴细胞杂交瘤(hybridoma)单克隆抗体技术 2(三) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超 10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用 8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于9 5％，也是决定细胞融合的关键。
(四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞��浆母细胞。
一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤(一) 细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
单抗体制备
单抗体制备引言单抗（monoclonal antibody）是指来源于单一克隆细胞的抗体，具有高度特异性和高亲和力。
单抗在医学、生物工程和疾病治疗等领域具有广泛应用前景。
本文将介绍单抗的制备方法，包括杂交瘤细胞制备、单克隆细胞培养和纯化等步骤。
一、杂交瘤细胞制备杂交瘤细胞是由B淋巴细胞（B lymphocyte）和骨髓瘤细胞（myeloma cell）融合而成的细胞系，具有无限增殖能力和产生单克隆抗体的能力。
制备杂交瘤细胞的步骤如下：1.1.采集B淋巴细胞从免疫动物（如小鼠）的脾脏或淋巴结中采集B淋巴细胞。
这些细胞是免疫系统中产生抗体的关键细胞。
1.2.准备骨髓瘤细胞选择一种骨髓瘤细胞系，如NS-1细胞或SP2/0细胞，作为杂交瘤的母细胞。
这些细胞具有无限增殖能力，适合用于制备杂交瘤细胞。
1.3.融合细胞将采集到的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合为杂交瘤细胞。
融合后的细胞称为杂交瘤。
二、单克隆细胞培养杂交瘤细胞具有无限增殖能力，但并不能产生单一的抗体。
为了获得单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进行单克隆化培养。
2.1.稀释培养将融合后的杂交瘤细胞进行稀释培养，使细胞以单个细胞的形式分散在培养基中。
这样可以使每个细胞形成一个单克隆。
2.2.筛选单克隆细胞将稀释后的杂交瘤细胞进行筛选，通常采用限稀稀释法或HTP法。
限稀稀释法是在培养基中加入一定浓度的杂交瘤细胞，使每个细胞在培养皿上形成单个克隆。
HTP法则是将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每个孔中只有一个细胞，便于单克隆的筛选。
2.3.培养和扩增单克隆细胞将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，可以使用无血清培养基，添加合适的生长因子和抗生素，促使细胞的生长和分裂。
三、单抗纯化经过单克隆细胞培养，可以得到大量的单克隆抗体，但其中还含有其他蛋白质和杂质。
为了获得纯净的单抗，需要进行纯化步骤。
3.1.采集培养上清将培养单克隆细胞的上清液收集起来，其中含有分泌的单克隆抗体。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验一、骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
二材料：
1.试剂：
（1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。
不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3 3.7g，100×L.G.溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。
（2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃ 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。
（3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
2.器材：
超净工作台、CO2恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等
三方法：
细胞冻存及复苏
先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml细胞瓶。
当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。
复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。
四、细胞培养应注意事项
1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒，对于新购置或已经使用的玻璃器皿，一般先用先用0.1%新洁而灭浸泡24小时，再用自来水清洗，晾干，然后放置酸缸浸泡24小时，带胶手套，捞起，用自来水将酸液冲洗干净（一般冲洗8-10次），用去离子水浸泡12小时，再用超纯水浸泡12小时，捞起烘干，细胞瓶用锡铂纸包扎瓶口，吸管塞上绵花，装入吸管桶内，165.5℃干热灭菌2-3小时，待冷却后，转入消毒柜里备用。
2. 培养基：大多数实验室采用的基础培养基是DMEM或RPMI-1640，按厂家规定的方法配制一般不会出问题。
但是配制培养基的水的质量和血清添加成分是影响融合最重要的培养基素因各地水质差异很大，所以至少应用三蒸水或四蒸水，并定期检查制成的纯水质量。
国内实验室大多采用新生犊牛血清配制培养基，不同来源和不同批次的血清支持杂交瘤生长的差异很大，应筛选出好的血清供作配制融合后选择性培养的HAT培养基。
准备重组药物的实验：
1、配制AMP+ LB固体培养基600ml，倒AMP+ LB平皿 20个
2、AMP+ LB液体培养基400ml
3、空的试管20支
4、1.5ml EP管1盒
将以上灭菌。
附：LB培养基配方：
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
另外根据经验值用5mol/LNaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。
LB固体培养基倒板
①配制：100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉
②抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
③倒板：一般20ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
④保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
抗生素终浓度Amp 100ug/ml
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。