细菌对抗菌药物敏感试验
细菌对药物的敏感试验
近年来，由于抗生素、磺胺等抗菌药物广泛应用，导致了耐药菌株不断出现。
测定细菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药，避免滥用药、及时有效地控制感染以及细菌鉴定，具有重要意义。
细菌敏感度的测定方法很多，世界卫生组织推荐的方法为Kirby-Bauer 纸片法，该方法具有操作简便、易于掌握、且重视性好的优点，本法是将含药纸片贴敷在接种细菌的琼脂平板上，利用含药纸片在琼脂上的扩散作用来测定细菌对药物的敏感性。
K-B纸片法的原理是建立在抗菌药物抑菌环直径大小与细菌的最小抑菌浓度（MIC）之间呈负相关的基础上，即抑菌环直径越大，则MIC越小。
结果判定：按抑菌环直径大小报告敏感、中度敏感或耐药。
敏感：是指被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的某种抗菌药物治疗。
中度敏感：是指通过提高种抗菌药物的剂量或在该药浓集的部位，细菌生长可被抑制，感染可被治愈。
这类药物毒性较小，剂量可以加大。
β-内酰胺类药物可出现中度敏感。
耐药：是指被测菌株所引起的感染不能用常规剂量的抗菌药物所治愈。
中介度：这一范围是“缓冲域”是由试验的误差造成的不作为报告形式。
如确需明确的敏感度，应重复实验或做稀释法，抑菌环为中介度的药物不可提高剂量。
最低抑菌浓度（MID）：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。
以针形接种器沾取菌液加至药盒各孔，35℃培养过夜，含抗菌素浓度最低而无细菌生长的（清亮孔），即为MIC。
最低杀菌浓度（MBC）：抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。
经48小时35℃培养后，含抗菌素浓度最低而无细菌生长的（清亮孔），即为MBC。
由于纸片法影响因素多，很难控制精度，现大多数医院采用MIC测定盒。
MIC由经典二倍肉汤稀释演化而来，具有终点判断精确，重复性好，操作简便等优点。
此方法采用病美国DYNATECH接种器，更具科学性。
使用国产“华士达微生物自动分析仪”所做的定量药敏（MIC）试验，报告自动由打印机印出，附印出抗菌素对受试菌的MIC外，还可提供各种药物的用量，给药途径（口服、肌注、静滴）及血和尿中可能达到的药物浓度一览表，供临床医师参考。
细菌对抗菌药物的敏感试验
（3）抗菌药物使用情况的变化会引起细菌耐药 情况的变化，如投入或停用某种抗菌药物常与其 耐药性的消长有关；
（4）抗菌药物使用愈多的区域耐药菌分布愈多；
（5）抗菌药物应用时间越长耐药菌定植的可能 性越大；
（6）抗菌药物剂量越大耐药菌定植或感染的机 会更多；
（7）抗菌药物对自身菌群有影响并有利于耐药 菌生长。
（3）氯霉素乙酰转移酶。此酶为一种胞内 酶，早在1987年，Lyon等就确定此酶由质 粒或染色体或转座子基因编码，主要作用 是使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的 代谢物。
（4）红霉素酯化酶。此酶是一种体质酶， 由质粒介导，主要作用是水解红霉素及大 环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去 抗菌活性。
地翻译而引起蛋白质合成受阻，从而引
起细菌死亡。
3、破坏胞浆膜的完整性
这类抗菌药主要是一些抗真菌的药物， 如两性霉素B（Amphotericin B），它们 主要能够与细菌细胞胞浆膜上的一些磷 脂成分结合，破坏胞浆膜的完整性，从 而导致细胞的裂解。
4、影响细菌的代谢途径 这类抗菌药的代表就是磺胺类（Sulfonamides）。
三、细菌耐药性产生的机理
细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因 机理两个方面：
(一）、生化机理：
1、细菌产生破坏药物结构的酶
这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多 种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌 细胞内的药物，使之失去生物活性。这是 引起细菌耐药性的最重要的机制，目前发 现和分离的钝化酶主要有以下4种：
上述概念虽然考虑到了细菌对抗菌药物 的敏感性，但却忽略了药物的剂量、浓 度和机体的耐受性。
从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏 感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓 度（抗菌药物通过常用途径和常用剂量 所能达到的血药浓度）与该抗菌药物对 细菌的最小抑菌浓度（MIC）的关系而 定：
17.抗菌药物敏感性试验
操作
待检菌液
无菌棉签 涂布
MH琼脂表面
室温 5min
贴含药纸片 35℃ 观察 16～18h 结果
操作注意事项：
• 菌液应在15分钟内接种完毕 • 注意纸片距离
＞15mm ＞24mm
3．结果解释
• 测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
• 敏感(susceptibile ，S) 推荐剂量的抗菌药物 在体内达到的血药浓度能抑制或杀死待测菌。
•常量肉汤稀释法 •微量肉汤稀释法 •琼脂稀释法
（一）肉汤稀释法
试管肉汤稀释法和微量肉汤稀释法。 1.试管肉汤稀释法
• 方法
– 抗 生 素 的 配 制 （ μ g/ml ） ： 512 、 256 、 128……
– 培养基：MH肉汤 – 待检菌液：107CFU/ml
方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
以扩大病原治疗的覆盖面； ② 治疗多种细菌所引起的混合感染； ③ 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用； ④ 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生； ⑤ 减少治疗指数低的抗菌药物的用量从而减轻其毒副
作用。
• 联合药敏试验的常用方法
– 纸片扩散法 – 棋盘法
• 特点：
– 操作简便同扩散法， – 同稀释法一样可以直接定量出测试药物对测试
M-H肉汤(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
抗生素(ml) 菌液(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1弃 －
去
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
35℃孵育16~18h，观察结果
一般细菌抗菌药物敏感试验稀释法
一般细菌抗菌药物敏感试验稀释法稀释法是用培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，再接种待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死细菌的最低药物浓度的体外办法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。
稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最低抑菌浓度（MIC)。
CLSI的M07文件系列对于MIC法给出了具体的标准。
（一）肉汤稀释法肉汤稀释法包括常量稀释法（macrodilution）和微量稀释法（microdilution)。
两者原理相同，只是反应液的体积不同。
前者采纳试管，每管中菌药混合物体积为2 mL；后者采纳微孔板，每孔菌药混合物的体积为0.1 mL。
1．原理用MH肉汤将抗菌药物对倍稀释，接种一定量的待测菌，以肉眼看不见细菌生长的最低药物浓度为MIC；此办法定量测定抗菌药物杀灭受试菌的最低浓度为最低杀菌浓度（minimal bactericidalconcentration,MBC)。
2．培养基MH肉汤为基础培养基，用于常规需氧菌和兼性厌氧菌检测。
而相对苛养的细菌，如和流感检测则需要添加养分成分。
虽然不是苛养菌，但也需要添加2％（质量浓度）的NaCI 以提高耐葡萄球菌的检出率。
3．药物稀释 (1)抗菌药物储存液的配制。
抗菌药物干粉不能挺直用于AST，普通保存在-20℃以下的干燥容器中。
用法前先配制抗菌药物储存液，其浓度起码为1000 ug/mL（如1280ug/ML）或最高实验浓度的10倍。
取少量体积的抗菌药物储存液于无菌玻璃、、或小瓶中，密封置于-60℃或更低温度，需要时解冻并且当天用法，用过的储存液应在24 h后丢弃。
大多数的抗菌药物储存液可在-60℃或更低温度保存6个月或以上，其活性无显著变幻。
(2)抗菌药物稀释液的配制。
药物稀释液的浓度参考CLSI M100文件表格2的说明折点，试验室可按照实际调节。
建议挑选的浓度范围起码包括一种质控菌的折点。
对药物储存液举行对倍稀释，其终浓度可为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 ug/mL（图10-3)。
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
细菌药敏试验
细菌药敏试验实训细菌的药物敏感性试验教学⽬标使学⽣掌握细菌药物敏感性试验的操作⽅法，能够利⽤本试验⽅法选择敏感药物治疗兽医临床常见的细菌性传染病。
材料准备1．器材：温箱、天平、打孔机、滤纸、⽆菌试管及吸管、镊⼦、接种环、酒精灯等。
2．试剂：蒸馏⽔。
3．培养基：普通琼脂平板。
4．菌种：⾦黄⾊葡萄球菌及⼤肠杆菌的固体培养物。
5．药品：链霉素、⾦霉素、新霉素、红霉素等抗菌药物。
6．硫酸钡标准管：取1%~1.5%氯化钡0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混匀即成，⽤前充分振荡。
⽅法步骤将抗菌药物置于接种待检菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的⽣长，从⽽出现抑菌环。
由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，由此可根据抑菌环的⼤⼩，判定细菌对药物的敏感度。
（⼀）含药纸⽚的制备1．滤纸⽚最好选⽤新华1号定性滤纸，⽤打孔机打成直径6mm的滤纸⽚，放在⼩瓶中或平⽫中，在121.3℃灭菌15min，再置100℃⼲燥箱内烘⼲备⽤。
2．药液的配制⽤⽆菌蒸馏⽔将各药稀释成以下浓度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、链霉素、⾦霉素、新霉素、红霉素、多粘菌素1000µg/ml。
3．含药纸⽚的制备将灭菌的滤纸⽚⽤⽆菌的镊⼦摊布于灭菌平⽫中，按每张滤纸⽚饱和吸⽔量为0.01ml计算，50张滤纸⽚加⼊药液0.5ml。
要不时翻动，使纸⽚充分吸收药液，浸泡1~2h后于37℃温箱中烘⼲备⽤。
对青霉素、⾦霉素纸⽚的⼲燥宜采⽤低温真空⼲燥法，⼲燥后⽴即放⼊瓶中加塞，放⼲燥器内或置-20℃冰箱中保存。
纸⽚的有效期⼀般为4~6个⽉。
（⼆）测验⽅法1．钩取⾦黄⾊葡萄球菌和⼤肠杆菌菌落各4~5个，分别接种于⾁汤培养基中，37℃培养4~6h。
2．⽤灭菌⽣理盐⽔稀释培养菌液，使其浊度相当于硫酸钡标准管。
装有以上两种成分的试管须相同，硫酸钡应⽤前需充分振动。
3．⽤⽆菌棉拭⼦蘸取上述⾁汤培养液，在试管壁上挤压除去多余的液体，在琼脂培养基表⾯均匀涂抹。
nccls细菌药物敏感试验判定标准
nccls细菌药物敏感试验判定标准
NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory Standards）细菌药物敏感试验判定标准是NCCLS提出的一套细菌药物敏
感试验判定标准，用于评估细菌对抗菌药物的敏感性。
该标准主要涉及细菌的敏感性等级、细菌的敏感性报告和药物敏感性测定方法等。
NCCLS细菌药物敏感试验判定标准的敏感性等级包括：非常
敏感（S）、敏感（I）、耐药（R）和非常耐药（V）。
其中，非常敏感（S）表示细菌在抗菌药物的抑制浓度低于最小抑制
浓度（MIC）的4倍以下时，可以被抑制；敏感（I）表示细
菌在抗菌药物的抑制浓度低于最小抑制浓度（MIC）的2倍以
下时，可以被抑制；耐药（R）表示细菌在抗菌药物的抑制浓
度低于最小抑制浓度（MIC）的2倍以上时，可以被抑制；非
常耐药（V）表示细菌在抗菌药物的抑制浓度低于最小抑制浓
度（MIC）的4倍以上时，可以被抑制。
NCCLS细菌药物敏感试验判定标准的细菌敏感性报告主要由
药物敏感性测定方法（如药物抑制浓度法、可溶性药物抑制浓度法等）得出的最小抑制浓度（MIC）和敏感性等级（S、I、
R和V）组成。
细菌对抗菌药物的敏感试验
•23
•24
•25
第二节 抗菌药物压力
一、抗菌药物压力 是细菌产生耐药的主要源动力。 1985年，著名学者McGowan指出了与医院 内细菌耐药性的出现相关的7个方面： （1）引起医院感染的微生物的耐药性比引 起社会感染的微生物的耐药性更多见； （2）医院中耐药菌株感染者使用的抗菌药 物比敏感株感染或定植者使用的抗菌药 物多；
抑菌商数越小，抑菌效果越差。
•18
三、细菌耐药性检测的常用方式
•19
标准结果判读表
•20
分界点的计算方法
选取一大群同种不同株的细菌做药敏试 验（至少选取100株，包括敏感菌株和耐 药菌株），求出该群细菌中每一菌株对 某抗菌药物的MIC及其相应的抑菌环直 径。因抗菌药物对细菌的MIC与其相应 的抑菌环直径呈负相关关系，据此可绘 制回归直线图。方法如下：
•17
目前，临床上选择抗菌药物，常根据抑菌 商数来选择。
所谓“抑菌商数”（Inhibitory Quotient，简称 IQ），是指某抗菌药物在局部组织或体液 中的浓度除以该药物对感染菌的最小抑菌 浓度所得的商数。即： 局部组织或体液中的药物浓度
IQ =
MIC 抑菌商数越大，抑菌效果越明显；反之，
因此，在使用抗菌药物的过程中，必须加强细菌 对抗菌药物敏感性的实验室监测，为临床上合理 使用抗菌药物提供试验依据。而细菌对抗菌药物 的敏感试验，就是对抗菌药物进行实验室监测的 主要手段之一。
•3
目的： 1、为临床上治疗某个病人选择最佳抗菌
药物，指导临床用药，避免由于用药不 当，导致耐药菌株产生或造成人体伤害 ； 2、进行流行病学调查，了解致病菌的耐 药变迁情况，为医疗行政主管部门的决 策提供依据；
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怀化医专《微生物学检验》教案编号：10细菌对抗菌药物敏感试验药敏试验(antimicrobial susceptibility,AST)（一）概念：在体外检测药物抑制或杀死细菌能力的试验。
（二）检测意义：1、疾病的治疗：指导用药。
2、耐药菌检测和流行病学调查。
3、评价新药抗菌作用。
4、某些菌种的鉴定。
第一节临床常用的抗菌药物抗菌药物：是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。
一、青霉素类抗生素：青霉素种类抗菌活性1、天然青霉素不产青霉素酶的G+G-球菌、普雷沃菌等。
青霉素G、青霉素V2、耐青霉素酶青霉素产青霉素酶的G+G-球菌甲氧西林、奈夫西林、苯唑西林等3、广谱青霉素青霉素G敏感细菌、大部分大肠埃希菌、氨苄西林、阿莫西林奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等G-菌替卡西林、羧苄西林、氨苄西林无效的G-菌，产β-内酰胺酶美洛西林、派拉西林克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌、厌氧菌二、头孢菌素类抗生素：1、第一代头孢菌素（头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢羟氨苄等）作用：对G+菌作用强，如金葡菌、链球菌等。
2、第二代头孢菌素（头孢羟唑、头孢呋辛、头孢克洛、头孢尼西、头孢雷特等）作用：产青β-内酰胺酶G-菌有作用，如肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌等。
3、第三代头孢菌素注射用头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢派酮：对产青β-内酰胺酶G-菌有很大抗菌活性。
口服用头孢克肟、头孢布坦等：对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无用。
4、第四代头孢菌素（头孢匹罗、头孢匹美）作用：对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌作用强。
三、其它β-内酰胺类抗生素：1、单环β-内酰胺类抗生素（氨曲南、卡芦莫南）对G-菌作用强2、头霉素类：对G+菌、厌氧菌作用较好氧头孢烯类抗生素：抗菌谱广，对产β-内酰胺酶G-菌作用强，对产酶的金葡菌有效3、碳青酶烯类抗生素（亚胺培南、米洛培南等）广谱（最广），抗菌活力强4、β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦）与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。
四、氨基糖苷类抗生素：链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星等作用：对需氧G-杆菌有强大抗菌活性对沙雷菌属、气单胞菌属、产碱杆菌、不动杆菌属、分枝杆菌属也有一定抗菌活性。
但对G-球菌效果差。
五、喹诺酮类抗生素：第一代：（新恶酸等）窄谱抗生素（G-）第二代：（环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等）对G+G-菌均有作用。
第三代：（斯帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等）超广谱抗生素。
六、大环内酯类抗生素：红霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素等作用：和青霉素相似，主要是G+菌、厌氧菌。
新一代：克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、阿齐霉素等。
七、四环素、氯霉素、林可酰胺类抗生素：八、糖肽类抗生素九、磺胺类药物及其增效剂药敏试验常规抗菌药物选择：根据NCCLS（National committee for clinical laboratory standars）非苛氧菌和苛氧菌有各自常规药敏试验标准。
在标准中分成ABCU四组——A组：常规首选药，作为一级试验并常规报告的抗生素。
B组：临床使用主要抗生素，在某些情况下使用。
为一级试验，有选择报告的抗生素。
C组：补充试验，有选择报告的抗生素。
用于对A组药物耐药的菌株或过敏的病人。
U组：仅用于泌尿道的补充试验的抗生素。
第二节需氧菌和兼性厌氧菌药物敏感试验一、纸片琼脂扩散法（K-B法）纸片扩散法是一种操作简单，易于掌握的半定量的药物抑菌测定法。
为使结果更可靠，1971年世界卫生组织推荐了Kirby-Bauer(K-B)法作为标准化的药敏方法。
该法要求所需试剂、药物纸片、培养基、菌液浓度以及操作方法都必须标准化，主要适宜于需氧菌和兼性厌氧菌的药敏测定，是目前临床工作中最常用的药敏试验方法。
（一）原理将含有抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板上，纸片中的药物吸收琼脂中水分后向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度，纸片周围的待测菌生长如果被该药物所抑制，就会形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映了待测菌对该测定药物的敏感程度，并与该药对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。
MIC（最低抑菌浓度）：抑制待测菌生长所需要的最小浓度。
（二）材料培养基，抗菌药物纸片，菌液等。
（三）实验步骤（四）影响因素（五）结果判断和报告测量抑菌圈直径，作出判断。
敏感（sensitivity）：待测菌株在体内可被常规剂量的测定药物抑制或杀灭。
中度敏感（morderate sensitivity）：指通过提高药物浓度或在该药生理性浓集部位，细菌生长可被抑制。
中介度（intermediate）：为“缓冲域”，以防止由技术因素失误导致的结果偏差。
不能作为临床报告。
耐药（resistant）：待测菌株不能被常规剂量的抗生素所抑制。
（六）质量控制1、质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853，粪肠球菌ATCC 29212或33186。
2、抑菌圈质控范围：各种抗菌药物对以上4种质控菌株的抑菌圈允许范围为95％可信限。
（即：实验室日间质控得到的抑菌圈直径在连续20个数值中仅允许1个超出范围）见P134表15－1二、稀释法为定量法，体外检测某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）值。
根据稀释培养基不同，分为：肉汤稀释法和琼脂稀释法。
（一）肉汤稀释法1、原理：用M-H液体培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）2、材料：抗菌药物原液，M-H液体培养基，菌液等3、步骤：稀释药物→加菌液，混匀→培养，检测结果注：每种药物稀释的浓度范围见P137页表15－44、结果判断：以肉眼观察无菌生长的最低药物浓度为该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。
再以0.01ml容量接种环从肉眼观察无菌生长的试管中取一环接种于血琼脂平板作次代培养，经35℃培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9％原始种入的细菌即为最低杀菌浓度（MBC）。
（二）琼脂稀释法1、原理：将待测菌接种于含有不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。
2、结果判断：以无菌落生长的最低药物浓度为该药对待测菌的MIC。
3、质量控制：标准菌株同前。
方法评价：本法的优点是可同时进行多株细菌的MIC测定，结果较液体稀释法可靠，且易于发现污染或耐药交叉菌株，为开发新药的体外药敏试验常用的参照标准；缺点是制备药物琼脂平板时费时费力。
三、联合药敏试验在制药工业中，为了得到抗菌增效的配方，常进行两种或两种以上抗菌药物复方制剂的筛选。
中成药也有配方中含多种抗菌药物的情况。
更重要的是在临床上，对于尚未确定由何种病菌引起的急、重症感染以及由多种细菌混合感染的治疗，常采取联合用药，以此获得较理想的疗效。
1、联合药敏试验的意义：（1）治疗混合性感染或未确定病原菌的急、重症感染（如败血症）；（2）预防或推迟细菌耐药的发生；（3）联合用药可以减少剂量避免达到毒性剂量；（4）联合用药比单一用药效果更好。
2、联合药敏试验的结果与类型（1）协同作用：两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。
（2）相加作用：两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和。
（3）无关作用：两种药物联合作用时的活性等于活性最大的抗菌药物的药效。
（4）拮抗作用：两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性。
3、联合药敏试验的方法（1）扩散法：（定性）如：单药纸片搭桥法，纸条扩散法。
（2）稀释法：（定量）棋盘法——是目前常用的定量联合抗菌试验法，由两种抗菌药物的不同稀释度加以组合，每一种药物浓度都有单独的和另一种药物不同浓度的联合，能精确测定出两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用，因其排列呈棋盘状而得名。
由于使用的培养基不同，又分液体棋盘稀释法和琼脂盘稀释法。
四、E试验是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。
原理：E试条是一条5×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先准备的、浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。
抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判别有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。
第三节细菌耐药性检查方法一、细菌耐药性表型检测（一）琼脂筛选试验：以单一药物单一浓度检测细菌的耐药性，常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐庆大霉素或链霉素的肠球菌。
（二）折点敏感试验：仅用特定抗生素浓度（敏感、中介、耐药折点MIC）测定细菌对药物的敏感性。
（三）双相纸片试验：是非NCCLS规定ESBL检测方法。
方法：挑取在血平板上生长的细菌菌落，稀释成0.5麦氏比浊管浓度，均匀涂布于M-H平板，中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片25mm处（中心－中心）分别贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻污、氨曲南等纸片作为指示剂，35℃孵育16～18h，若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待测菌产生超广谱β－内酰胺酶（ESBL）。
（四）自动化仪器二、β－内酰胺酶检测1、头孢硝噻吩滤纸片法用接种环挑取待测菌菌落于商品化头孢硝噻吩滤纸片上，于10min内由黄色变为红色即（＋）。
2、碘淀粉测定法待测菌落＋青霉素溶液→室温振摇30min＋淀粉＋碘液→溶液变蓝→继续振摇，10min内变为无色为（＋）。
三、其它：耐药基因检测，特殊耐药菌检测第四节体外抗菌试验的影响因素体外抗菌试验受培养基、试验细菌、药物本身以及其它因素的影响。
试验时，只有严格控制试验条件，才能保证实验结果的准确性，重复性及科学性。
一、培养基的成份尽量使用成份较简单的培养基，培养基中应避免含有药物的干扰物质和拮抗物质，如钙、镁离子可以降低氨基糖苷类药物的抗菌活性；胸腺嘧啶核苷和对氨基苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性，目前大多使用M-H培养基。
二、培养基的PH培养基的PH值应在7.2-7.4之间，太酸或太碱不仅会直接影响细菌的生长，更重要的是还影响药物的抗菌活性。
培养基的PH值可以改变药物的离子化程度而影响药物渗入细胞内。
一般情况下，非离子化的物质比离子化的物质更易进入细菌壁和细菌膜。
三、试验菌的菌种及菌量试验菌种必须是标准菌株，如金黄色萄葡球菌ATCC 25923，大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853及粪肠球菌 ATCC 29212等。