色谱基础
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色谱基础知识
紫外可见光检测器对环境温度、流速、流动相组成等的变化不敏感，可用于梯度洗脱，具有选 择性好、灵敏度高、噪声低等优点，再高效液相色谱中应用最广，几乎所有的液相色谱仪都配 备有紫外可见光检测器。部分仪器厂家还配备了双波长检测器。
紫外检测器使用前需要预热，待基线稳定后再进样，流通池与管路漏液或堵塞时应及时处理。 使用时应关闭检测器前面板，紫外检测器流通池耐压指标为12MPa（12μL），是所有液相检测 器中最高。，两台检测器串联使用时应先经过紫外检测器再串联其他检测器。氘灯的保证使用 时间是2000小时，使用时不要频繁开关，如果2000小时内氘灯故障可以联系厂家更换。如果使 用时间超过2000小时，氘灯能量正常还可以继剂效应：溶剂效应（solvent effect）亦 称“溶剂化作用”。指液相反应中，溶剂 的物理和化学性质影响反应平衡和反应速 度的效应。溶剂化本质主要是静电作用。 对中性溶质分子而言，共价键的异裂将引 起电荷的分离，故增加溶剂的极性，对溶 质影响较大，能降低过渡态的能量，结果 使反应的活化能减低，反应速度大幅度加 快。
荧光检测器具有极高的灵敏度和良好的选择性，比紫外检测器的灵敏度高两个数量级，特别适 用于痕量分析，在环境检测、药物分析、生化分析中有着广泛的用途。多环芳烃、霉菌毒素、 卟啉、儿茶酚氨等都可用荧光检测器检测。对于某些本身不发荧光的物质，如氨基酸、脂肪酸 可利用化学衍生技术使其生成荧光衍生物再进行检测。荧光检测器对温度、流量变化不敏感， 可以使用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱相关知识
色谱柱通常安装再柱温箱内起到恒温恒压提高柱效延长柱寿命的目的，安装柱子时需要注意流 动相的方向，下进上出以排除气泡，根据分析的目的选择合适的色谱柱。
高效液相色谱柱相关知识
反相模式是第一选择，其中又以C18柱最为常见，反相离子对色谱和正向色谱是第二选择。 色谱柱连接时应避免产生死体积，常用的色谱连接头是peek接头，连接peek接头时如果peek接 头管线伸出的长度不够将产生缝隙，这就是柱外死体积；如果死体积产生再进样器出口处，上样体 积将增加，样品将展宽。如果死体积产生再色谱柱出口，本来分离的样品又混合了，一同进入检测 器，样品分离度将下降。死体积严重时甚至可能会导致漏液、色谱峰形劣化、重复性差。
紫外检测器使用前需要预热，待基线稳定后再进样，流通池与管路漏液或堵塞时应及时处理。 使用时应关闭检测器前面板，紫外检测器流通池耐压指标为12MPa（12μL），是所有液相检测 器中最高。，两台检测器串联使用时应先经过紫外检测器再串联其他检测器。氘灯的保证使用 时间是2000小时，使用时不要频繁开关，如果2000小时内氘灯故障可以联系厂家更换。如果使 用时间超过2000小时，氘灯能量正常还可以继剂效应：溶剂效应（solvent effect）亦 称“溶剂化作用”。指液相反应中，溶剂 的物理和化学性质影响反应平衡和反应速 度的效应。溶剂化本质主要是静电作用。 对中性溶质分子而言，共价键的异裂将引 起电荷的分离，故增加溶剂的极性，对溶 质影响较大，能降低过渡态的能量，结果 使反应的活化能减低，反应速度大幅度加 快。
荧光检测器具有极高的灵敏度和良好的选择性，比紫外检测器的灵敏度高两个数量级，特别适 用于痕量分析，在环境检测、药物分析、生化分析中有着广泛的用途。多环芳烃、霉菌毒素、 卟啉、儿茶酚氨等都可用荧光检测器检测。对于某些本身不发荧光的物质，如氨基酸、脂肪酸 可利用化学衍生技术使其生成荧光衍生物再进行检测。荧光检测器对温度、流量变化不敏感， 可以使用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱相关知识
色谱柱通常安装再柱温箱内起到恒温恒压提高柱效延长柱寿命的目的，安装柱子时需要注意流 动相的方向，下进上出以排除气泡，根据分析的目的选择合适的色谱柱。
高效液相色谱柱相关知识
反相模式是第一选择，其中又以C18柱最为常见，反相离子对色谱和正向色谱是第二选择。 色谱柱连接时应避免产生死体积，常用的色谱连接头是peek接头，连接peek接头时如果peek接 头管线伸出的长度不够将产生缝隙，这就是柱外死体积；如果死体积产生再进样器出口处，上样体 积将增加，样品将展宽。如果死体积产生再色谱柱出口，本来分离的样品又混合了，一同进入检测 器，样品分离度将下降。死体积严重时甚至可能会导致漏液、色谱峰形劣化、重复性差。
色谱理论基础
（动画）
09:14:25
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔 板数：n，则三者的关系为：
n=L/H 色谱峰的方差 与柱长或保留时间的关系为：
H
2 L
L
t2 L
t
2 R
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
09:14:25
d2 f
d2 f
2.载气流速与柱效——最佳流速
载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主 要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的 主要因素，流速,柱效 。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影 响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度 对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速 即为最佳流速。
区域宽度──色谱过程的动力学因素。
色谱分离中的四种情况如图所示：
09:14:25
讨论：
色谱分离中的四种情况：
① 柱效较高，△K(分配系数)较大，完全分离。 ② △K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③柱效较低，△K较大，但分离的不好。 ④ △K小，柱效低，分离效果更差。
09:14:25
分离度的表达式：
09:14:25
例题2：
在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和 12.8s，计算分离度（柱长 1m，n=3600）。要达到完全 分离，即R=1.5，所需要的柱长。 解： t 4 12.2
Wb1 4
R1
3600 t R 2 4 12.8 Wb 2 4 0.8533 n 3600
09:14:25
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔 板数：n，则三者的关系为：
n=L/H 色谱峰的方差 与柱长或保留时间的关系为：
H
2 L
L
t2 L
t
2 R
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
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d2 f
d2 f
2.载气流速与柱效——最佳流速
载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主 要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的 主要因素，流速,柱效 。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影 响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度 对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速 即为最佳流速。
区域宽度──色谱过程的动力学因素。
色谱分离中的四种情况如图所示：
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讨论：
色谱分离中的四种情况：
① 柱效较高，△K(分配系数)较大，完全分离。 ② △K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③柱效较低，△K较大，但分离的不好。 ④ △K小，柱效低，分离效果更差。
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分离度的表达式：
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例题2：
在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和 12.8s，计算分离度（柱长 1m，n=3600）。要达到完全 分离，即R=1.5，所需要的柱长。 解： t 4 12.2
Wb1 4
R1
3600 t R 2 4 12.8 Wb 2 4 0.8533 n 3600
色谱基础知识
色谱基础知识1.名词狭义：色谱—1903俄国科学家茨维特提出，色谱就是色带。
广义：色谱系统—采用固定相和流动相分离混合物的系统。
载气－气体流动相carrier gas担体－色谱柱中的固定相，可以是颗粒物质，毛细管的管壁也可以起到担体的作用。
支持固定液or分离作用。
DEGS，硅藻土、固定液－涂布在担体表面的高沸点有机物。
OV225并不是每个色谱柱都需要担体和（或）固定液。
柱容量：色谱柱能一次有效分离的物质最大量。
决定了进入色谱柱的样品量。
内因由物质的种类决定，外因主要由色谱柱横断面上分离作用组分的量决定。
脉冲式进样器：分流装置：保留时间：（Rt reserve time）物质在色谱柱中的停留时间。
影响因素：一是固定液或者担体与被分析的物质之间作用力；二是色谱条件，包括使用的温度、载气种类及流速、升温方式（程序升温或者恒温条件）；Porapak Q2m,N2,30ml/min,110℃,140℃。
2.色谱分类固定相：纸色谱，薄层色谱，柱色谱，流动相：液相色谱liquid chromatograph（离子色谱），气相色谱gas chromatograph，电色谱，磁色谱，超临界流体色谱气固色谱－气体流动相和固定相（担体）组成的色谱系统gas solid chromatograph，GSC，担体的极性决定色谱柱的极性。
吸附色谱气液色谱－气体流动相、（担体和）固定液组成的色谱系统gas liquid chromatograph，GLC，固定液的极性决定色谱柱的极性。
分配色谱超临界流体色谱－介于气相色谱和液相色谱之间的一种色谱。
电色谱－毛细管电泳，凝胶电泳磁色谱－有待开发3.几种色谱柱径流效应：分离度：两种物质被分离开的程度。
分子结构相似度（内因），色谱条件（外因）：柱种类，温度，气体，柱长毛细管色谱柱－内径很小的色谱柱（一般在0.20mm，0.25mm，0.32mm，0.52mm左右），对上样操作要求比较高；把固定液直接涂布在色谱柱的（内）管壁上，固定液（se30）厚度一般在微米（0.25µm）数量级。
色谱基础
图4－7 某组分的色谱图
12
（1）色谱术语 ：保留时间、调整保留时间、 保留体积、调整保留体积
• 保留时间（retention time）:从进样到组分峰顶点之间测得的时 间，用tR表示。 • 调整保留时间（adjusted retention time）：组分的保留时间扣除 死时间后的时间。 • 保留体积（retention volume）：从进样开始到监测器中样品浓 度最大时，流动相流经色谱柱的体积。 • 调整保留体积（adjusted retention volume）:保留体积扣除死体 积后的体积。
即相对保留因子可以用来表示固定相的选择性，因 此也称为选择性系数（用α表示） ，可以用来衡量固
定相是否选择合适。
15
（1）色谱术语 ：相对保留因子(也称选择性系数)
采用相对保留因子可以消除一些仪器操作条件的 影响。只要柱温，固定相和流动相的性质保持不 变，即使柱长、柱径、填充情况及流动相的流速 有所变化，由于相对保留值在较短的时间间隔内 进行测定，实验条件队保留值的影响在分子、分 母中都存在，其比值仍基本保持不变，因此她是 气相色谱中广泛使用的定性数据。
色谱理论研究物质在色谱过程中的运动规律，如解释色谱流 出曲线的形状，色谱峰变宽的机理，从而为色谱分离条件的 选择提供理论指导。
基本 理论
塔板理论 速率理论
分离度
A、B两组分分离所要满足的条件： 1.两组分的分配系数有差异 2.区域扩宽的速率小于区域分离的速率 3.有足够长的色谱柱
19
§4-2
色谱理论简介
色谱 图
图4－4 某组分的色谱图
10
（1）色谱术语：基线与基线漂移
• 基线：在色谱操作条件下，仅有流动相通过监测器时，由 记录仪得到的信号－时间曲线。 • 基线漂移：基线随时间定向缓慢地变化。
色谱基础理论分配系数与分配比课件
配比的更精确控制。
03
毛细管电泳（CE）
毛细管电泳是一种基于电场驱动的分离技术，具有高分离效率和低溶剂
消耗的优点。通过优化毛细管电泳的分离条件，可以实现对分配系数和
分配比的精确调控。
理论研究的深入与发展
数学模型
深入研究色谱过程的数学模型， 通过建立更精确的模型来描述分 配系数和分配比的行为，有助于
1970年代
出现了高效液相色谱（HPLC ），提高了分离效率和灵敏度
。
色谱技术的应用领域
化学工业
用于分离和纯化各种有 机和无机化合物。
医药行业
用于药物生产和质量控 制，以及临床检测和诊
断。
环境监测
用于检测空气、水和土 壤中的污染物。
食品分析
用于检测食品中的添加 剂、农药残留和营养成
分。
02 分配系数与分配比的概念
压力波动会影响色谱柱的性能和溶质的分离效果。保持压力稳定是保证色谱分离效果的重要因素。
压力与流速
压力与流速之间存在关系，压力增大通常会导致流速减小，从而影响溶质的迁移时间和色谱分离效果 。
04 分配系数与分配比的实际应用
CHAPTER
在化合物分离中的应用
分离原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异，使不同物质在色谱 柱上得到分离。
实验结果分析
步骤1
根据标准品和样品的峰面积， 计算分配系数和分配比。
步骤2
分析实验结果，比较标准品和 样品的分配系数和分配比，判 断样品是否符合要求。
步骤3
根据实验结果，调整流动相的 浓度和比例，优化分离效果。
步骤4
整理实验数据，撰写实验报告 。
06 分配系数与分配比的未来发展
色谱基础知识
色谱基础知识
分离系统：色谱柱
色谱基础知识
分子筛柱： 主要用于分离分离永久气体，如He、H2、O2+Ar、N2、CH4、CO等
400000 300000
CH4 O2
MS 6/4 4m MS 1/8" 3m
200000
N2
H2
100000
CO
0
Minutes
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
-100000
色谱基础知识
色谱基础知识
几个基本概念： Chromatography：色谱法，一种分离和分析的方法 Chromatograph： 色谱仪，以色谱法为原理的分析仪器 Chromatogram： 色谱图，色谱仪生成的分析结果
色谱基础知识
Chromatography 色谱法：
色谱法是一种分离和分析方法，又叫层析法，它利 用不同物质在不同相态间的选择性分配，以流动相对 固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会 以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
7
S2
10
6
R2
9
IN2
ANALYSIS
D
OUT2
B
OUT1
TCD DETECTOR
S2
S1
R2
R1
E
A – 参比气入口 B – 参比气出口 C – 测量气入口 D – 测量气出口 E – 测量室
C
IN2
A
IN1
热导检测器 Thermal Conductive Detector
色谱基础知识
色谱基础知识
保留时间是色谱法定性的依据。
色谱基础知识
目前色谱法是生命科学、材料科学、环境科学、医药科学、 食品科学/安全、法庭科学以及航天科学等研究领域的重要手段。 各种色谱仪器已经成为各类研究室、实验室极为重要的仪器设备。
色谱的优点
★ 分离效率高 ★ 分析速度快 ★ 应用范围广 ★ 样品用量少 ★ 灵敏度高 ★ 分离和测定同步完成 ★ 易于自动化，可在工业流程中使用
高分子多孔微球：新型的有机合成固定相（苯乙烯/二乙烯苯共聚）。 适用于水、气体及低级醇的分析。
②气液色谱：溶质在固定相和流动相中进行分配，通过分子间作用力
（色散力、静电力、诱导力、氢键）的差异实现分离。
固定相=载体+固定液
对载体的要求：√具有化学惰性
√具有热稳定性
√具有一定的机械强度 √具有适当的比表面
ECD1A, ECD1A, 前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
归一化 325
相交的两点之间的距离，W=1.698644× W ECD1A,ECD1A,前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
300
1/2
归一化
275
800 700
250
600
225
500
200
W1/2
h
400 300
色谱的发展历程
1931年，Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验，用氧化铝和碳 酸钙做固定相分离出了3中胡萝卜素（α、β、γ），此后用这种方法 分离了60多种这类色素。
1940年，Martin和Synge提出液液分配色谱法。 1941年， Martin和Synge提出用气体代替液体做流动相的可能。 此后的11年内，James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气 液色谱方法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。 1956年，Van Deemter提出速率理论。1965年Giddings对其进 行了总结和发展。 1957年，Golay开创了毛细管柱气相色谱法。
色谱的优点
★ 分离效率高 ★ 分析速度快 ★ 应用范围广 ★ 样品用量少 ★ 灵敏度高 ★ 分离和测定同步完成 ★ 易于自动化，可在工业流程中使用
高分子多孔微球：新型的有机合成固定相（苯乙烯/二乙烯苯共聚）。 适用于水、气体及低级醇的分析。
②气液色谱：溶质在固定相和流动相中进行分配，通过分子间作用力
（色散力、静电力、诱导力、氢键）的差异实现分离。
固定相=载体+固定液
对载体的要求：√具有化学惰性
√具有热稳定性
√具有一定的机械强度 √具有适当的比表面
ECD1A, ECD1A, 前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
归一化 325
相交的两点之间的距离，W=1.698644× W ECD1A,ECD1A,前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
300
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归一化
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W1/2
h
400 300
色谱的发展历程
1931年，Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验，用氧化铝和碳 酸钙做固定相分离出了3中胡萝卜素（α、β、γ），此后用这种方法 分离了60多种这类色素。
1940年，Martin和Synge提出液液分配色谱法。 1941年， Martin和Synge提出用气体代替液体做流动相的可能。 此后的11年内，James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气 液色谱方法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。 1956年，Van Deemter提出速率理论。1965年Giddings对其进 行了总结和发展。 1957年，Golay开创了毛细管柱气相色谱法。
色谱分析法理论基础
（1）用时间表示的保留值（二）_
调整保留时间 t ‘的R：保指留扣时除间了，死如时图间中 的A'B。
即：t'R = tR－ tM
注意：当固定相一 定，在确定的实验条 件下，任何物质都有 一定的保留时间，它 是色谱分析法的基本 参数。
（2）用体积表示的保留值
保留体积VR：指从进样 到柱后出现待测组分浓 度极大值时所通过的载 气体积。
区域宽度（三）
（3）峰基宽度Wb：即通 过流出曲线的拐点所作的 切线在基线的截距，如图 I J所示。 Wb与σ的关系：
Wb ＝4σ
7.2.2 色谱法中的主要参数和关系式
分配系数Kp和容量因子K '
（1）分配系数Kp：定温定压下物质在固定相和流动相中的 浓度比。 KP＝[A]s / [A]m （s－固定相； m－流动相）
• R＝ 0.59R'
7.2.5 分离效率的表示方法－分离度（四）
关于R、n有效、r2.1、H有效、L柱长间关系如下：
R= r 2.1 1
r 2.1
n有效 16
n有效＝16R2
r
r 2.1 2.1
1
2
L＝16R2
r 2.1 2 r 2.1 1
H有效
H有效=L / n有效
对于一定的色谱柱和一定的难分离物质对，在一定
❖扩散的严重与否，关键是取决于流动相的线速 度。
7.2.4 影响色谱柱效能的因素 ——速率理论（五）
C － 固定相传质阻力项 D － 流动相传质阻力项 (非平衡状态作用)
此两项对色谱峰的影响均与流速成正比。在流速很 高的情况下，由于没有足够的时间建立平衡，偏离更为 严重。
对于一定的色谱体系，速率方程中A、B、C、D其 值为一定。速率方程描述了流动相的平均线速度对柱 效能的影响。
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自动化程度 TLC < HPLC 高效 快速 HPLC > TLC 费 用 TLC < HPLC
柱效 流动相和固定相相互作用达到平衡的时间
分离是一个物理过程
流动相的物态
色谱学分类
i）流动相： a. 气相——气相色谱（G.C） b. 液相——液相色谱（L.C） c. 超临界流体——超临界流体色谱（S.F.C）
ii）固定相 a. 液相（有机高沸点液体，以物理或化学法结合在惰 性固体表面） b. 固相（吸附剂）
vi) 疏水作用色谱 （HIC） vii) 手性色谱 （CC）
吸附色谱 流动相极性小于固定相极性 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3），具表面活性吸附中心
Ka与组分的性质、吸附剂 的活性、流动相的性质及 温度有关
分配色谱
80%
流动相极性大于固定相极性
固定相→机械吸附在惰性载体上的液体或特定修饰物
流动相→必须与固定相不为互溶
ii） 非理想色谱 （non-ideal chromatography）
按进样方式
i） 间歇式（batch chromatography） ii） 连续式（continuous chromatography）
a） 模拟流动床色谱（SMBC） b） 圆筒色谱（CAC）
按流动相动力源
i） 离 心 色 谱 ii） 重 力 色 谱 iii）高 压 色 谱 iv）电 动 色 谱
载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应
K与组分的性质、流动 相的性质、固定相的性 质以及柱温有关
离子交换色谱（IEC） 固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分→离子型的有机物或无机物
阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
色谱学基础
谱
[新华字典] 依照事物的类别、系统制的表册
-graphy
[edit] Suffix Represents something written or represented in the specified manner, or about a specified subject.
色谱学的发展与分类 HPLC与其它色谱法的比较
分离基于样品组分在非极性固定相和流动相中的溶解度/相互作用不同
iii）离子交换色谱（IEC）
根据样品组份离子交换亲和力的差异分离
iv）亲和色谱（AC）
根据样品组份与固定相疏水相互作用的差异分离
v） 体积排阻色谱（SEC）
GPC：固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC：固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
扩散系数 (cm2/s) 0.1~0.4
10－4~10－3
(0.2~3) ×10－5
“超临界状态是一种亚稳态”
按色谱柱形状
i）柱形——柱色谱（column Chromatography） 填充柱（packed column chromatography） 毛细管柱（capillary chromatography）
基质：通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成 凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。
亲和色谱法（AC） Affinity chromatograph
体积排阻色谱（SEC）
固定相→多孔性凝胶 流动相→水（GFC） 流动相→有机溶剂（GPC）
利用被测组分分子大小不同、在固 定相上选择性 渗透实现分离。 Kp 仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径 大小，与流动相的性质无关
Tswett 的实验
1913 实验
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 将碾碎之植物叶片的石油醚提取 液灌入柱中 随着石油醚提取液向下流过柱子， 现出展宽的色带
1915 发表
Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即 现在的Chromatography(色谱法)
1938年，Izmailv等发表了薄层色谱法论文 1944年，Consden等发表了纸色谱法论文 1952年，James用气相色谱法分离了低沸点的脂肪 酸，奠定了气相色谱的基础，60年代基本成熟。 1959 商品化GC 出现，效率高 1970s HPLC出现 1980s 毛细管电泳 2004年，Waters提出了UPLC
Gas
T/℃
Critical point
流体的一些物理性质比较
流体
密度(g/mL)
动态粘度 (g/(cms))
气体(101.3kPa, 21℃)
超临界流体(Tc, Pc~4Pc)有机溶剂（室温）(0.62) ×10－3 0.3~0.8
0.6~1.6
(1~3) ×10－4
(1~3) ×10－4
(0.2~3) ×10-2
ii）平板——平板色谱（plane chromatography） 纸色谱（paper chromatography） 薄层色谱（thin layer chromatography）
按色谱机理
i） 吸附色谱（正相色谱，NPC）
根据样品组分对极性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离
ii） 分配色谱（反相色谱，RPC）
按操作参数
i） 温度 （恒温，程序升温）
ii） 流动相组成 （恒组成—等度 isocratic）
按热力学特性
i） 线性色谱 （linear chromatography）
ii） 非线性色谱 （nonlinear chromatography）
按动力学特性
i） 理想色谱 （ideal chromatography）
亲和色谱法（AC） Affinity chromatograph
定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生 物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。
固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不 溶性固体基质上制得。
生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、 辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多 糖）、抗生素（核苷酸）等。
超临界流体（ Supercritical Fluid，SCF）
是指在临界温度和临界压力以上的流体，高于临界温度和临 界压力而接近临界点状态，称为超临界状态。处于超临界状 态时，气液两相性质非常接近，以至于无法分辨。
P/Pa
Solid
Triple point
Liquid
Supercritical fluid
柱效 GC > HPLC 应用范围 HPLC > GC
费用 GC < HPLC 结论：凡是用GC与HPLC都可分析的样品原则上用GC。
（2） HPLC与SFC比较 柱效 SFC > HPLC
应用范围 SFC < HPLC （尤其是对极 性分子和生物大分子，如蛋白，核酸）
费用 SFC > HPLC
（3） HPLC与TLC比较
选择性系数
KS
[RSO3 X ]S [H ]m [RSO3 H ]S [ X ]m
[RSO3 X ]S [ X ] [RSO3 H ]S [H ]m
依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离。
Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、 离子交换树脂
性质以及温度有关
HPLC与LC相比较
（1） 流动相输送 HPLC——高压 LC——低压
（2） 固定相 HPLC——1.7~20um，球形 LC——40~200um，无定形
（3） 检测 HPLC——高灵敏度自动检测器 LC——收集馏分手工比色检测
HPLC与GC比较
GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量 大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。
GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力， 仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它 对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此， 流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数， 这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
色谱法的原理 是利用样品中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等 化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相 中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。
相 特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均 匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。
固定相(Stationary Phase), 流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂
柱效 流动相和固定相相互作用达到平衡的时间
分离是一个物理过程
流动相的物态
色谱学分类
i）流动相： a. 气相——气相色谱（G.C） b. 液相——液相色谱（L.C） c. 超临界流体——超临界流体色谱（S.F.C）
ii）固定相 a. 液相（有机高沸点液体，以物理或化学法结合在惰 性固体表面） b. 固相（吸附剂）
vi) 疏水作用色谱 （HIC） vii) 手性色谱 （CC）
吸附色谱 流动相极性小于固定相极性 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3），具表面活性吸附中心
Ka与组分的性质、吸附剂 的活性、流动相的性质及 温度有关
分配色谱
80%
流动相极性大于固定相极性
固定相→机械吸附在惰性载体上的液体或特定修饰物
流动相→必须与固定相不为互溶
ii） 非理想色谱 （non-ideal chromatography）
按进样方式
i） 间歇式（batch chromatography） ii） 连续式（continuous chromatography）
a） 模拟流动床色谱（SMBC） b） 圆筒色谱（CAC）
按流动相动力源
i） 离 心 色 谱 ii） 重 力 色 谱 iii）高 压 色 谱 iv）电 动 色 谱
载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应
K与组分的性质、流动 相的性质、固定相的性 质以及柱温有关
离子交换色谱（IEC） 固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分→离子型的有机物或无机物
阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
色谱学基础
谱
[新华字典] 依照事物的类别、系统制的表册
-graphy
[edit] Suffix Represents something written or represented in the specified manner, or about a specified subject.
色谱学的发展与分类 HPLC与其它色谱法的比较
分离基于样品组分在非极性固定相和流动相中的溶解度/相互作用不同
iii）离子交换色谱（IEC）
根据样品组份离子交换亲和力的差异分离
iv）亲和色谱（AC）
根据样品组份与固定相疏水相互作用的差异分离
v） 体积排阻色谱（SEC）
GPC：固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC：固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
扩散系数 (cm2/s) 0.1~0.4
10－4~10－3
(0.2~3) ×10－5
“超临界状态是一种亚稳态”
按色谱柱形状
i）柱形——柱色谱（column Chromatography） 填充柱（packed column chromatography） 毛细管柱（capillary chromatography）
基质：通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成 凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。
亲和色谱法（AC） Affinity chromatograph
体积排阻色谱（SEC）
固定相→多孔性凝胶 流动相→水（GFC） 流动相→有机溶剂（GPC）
利用被测组分分子大小不同、在固 定相上选择性 渗透实现分离。 Kp 仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径 大小，与流动相的性质无关
Tswett 的实验
1913 实验
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 将碾碎之植物叶片的石油醚提取 液灌入柱中 随着石油醚提取液向下流过柱子， 现出展宽的色带
1915 发表
Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即 现在的Chromatography(色谱法)
1938年，Izmailv等发表了薄层色谱法论文 1944年，Consden等发表了纸色谱法论文 1952年，James用气相色谱法分离了低沸点的脂肪 酸，奠定了气相色谱的基础，60年代基本成熟。 1959 商品化GC 出现，效率高 1970s HPLC出现 1980s 毛细管电泳 2004年，Waters提出了UPLC
Gas
T/℃
Critical point
流体的一些物理性质比较
流体
密度(g/mL)
动态粘度 (g/(cms))
气体(101.3kPa, 21℃)
超临界流体(Tc, Pc~4Pc)有机溶剂（室温）(0.62) ×10－3 0.3~0.8
0.6~1.6
(1~3) ×10－4
(1~3) ×10－4
(0.2~3) ×10-2
ii）平板——平板色谱（plane chromatography） 纸色谱（paper chromatography） 薄层色谱（thin layer chromatography）
按色谱机理
i） 吸附色谱（正相色谱，NPC）
根据样品组分对极性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离
ii） 分配色谱（反相色谱，RPC）
按操作参数
i） 温度 （恒温，程序升温）
ii） 流动相组成 （恒组成—等度 isocratic）
按热力学特性
i） 线性色谱 （linear chromatography）
ii） 非线性色谱 （nonlinear chromatography）
按动力学特性
i） 理想色谱 （ideal chromatography）
亲和色谱法（AC） Affinity chromatograph
定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生 物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。
固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不 溶性固体基质上制得。
生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、 辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多 糖）、抗生素（核苷酸）等。
超临界流体（ Supercritical Fluid，SCF）
是指在临界温度和临界压力以上的流体，高于临界温度和临 界压力而接近临界点状态，称为超临界状态。处于超临界状 态时，气液两相性质非常接近，以至于无法分辨。
P/Pa
Solid
Triple point
Liquid
Supercritical fluid
柱效 GC > HPLC 应用范围 HPLC > GC
费用 GC < HPLC 结论：凡是用GC与HPLC都可分析的样品原则上用GC。
（2） HPLC与SFC比较 柱效 SFC > HPLC
应用范围 SFC < HPLC （尤其是对极 性分子和生物大分子，如蛋白，核酸）
费用 SFC > HPLC
（3） HPLC与TLC比较
选择性系数
KS
[RSO3 X ]S [H ]m [RSO3 H ]S [ X ]m
[RSO3 X ]S [ X ] [RSO3 H ]S [H ]m
依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离。
Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、 离子交换树脂
性质以及温度有关
HPLC与LC相比较
（1） 流动相输送 HPLC——高压 LC——低压
（2） 固定相 HPLC——1.7~20um，球形 LC——40~200um，无定形
（3） 检测 HPLC——高灵敏度自动检测器 LC——收集馏分手工比色检测
HPLC与GC比较
GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量 大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。
GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力， 仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它 对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此， 流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数， 这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
色谱法的原理 是利用样品中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等 化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相 中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。
相 特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均 匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。
固定相(Stationary Phase), 流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂