分子生物学第六章

Taq DNA 聚合酶 3D结构
嗜热水生细菌 (Thermus aquaticus)
PCR 过程
1. 模板变性 (Denaturation) 双链 DNA 模板在 95C 变 性为单链 DNA。 2. 引物退火 (Annealing) 引物与单链 DNA 互补并退 火。 3. 延伸反应 (Extention) 热稳定 DNA 聚合酶催化子 链的合成。
3. 基因动、植物的检测 (1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 (2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。
正常人血红蛋白 亚基源自镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基
PCR
正常人血红蛋白 亚基编码基因
DdeI 酶切
琼脂糖凝胶电泳
镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基编码基因
核酸分子杂交 (Hybridization of nucleic acids)
具有高度敏感性：用于检测微量的 DNA 或 RNA 样品； 检测每一次 PCR 循环中产物的积累； 扩增反应结束后不需要对PCR 产物进行电泳。
CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
PCR 反应体系
• • 缓冲液 (Tris-HCl, KCl) MgCl2 或 MgSO4
•
• • • •
DNA 模板
上游引物 (upstream primer, sense primer) 下游引物 (downstream primer, antisense primer) 底物 dNTPs 热稳定 DNA 聚合酶
核酸分子杂交
两条互补的 DNA 单链或一条 DNA 单链与其互补的 RNA 链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交通常是指探针与受体 DNA 或 RNA 分 子的之间的杂交。
探针 (probe)
用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链 (单 链 DNA 或 RNA 分子) 称为探针。 探针用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。
用作内参的管家基因
• -actin • GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) • 18S rRNA
Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR
在 PCR 反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号的 积累实时监测 PCR 反应进程，对扩增的 PCR 产物进行定量 分析的方法。
AMOUNT OF DNA 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536 131,072 262,144 524,288 1,048,576 2,097,152 4,194,304 8,388,608 16,777,216 33,554,432 67,108,864 134,217,728 268,435,456 536,870,912 1,073,741,824 1,400,000,000 1,500,000,000 1,550,000,000 1,580,000,000
两个引物分子形成二聚体 5’ ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAGCACCGATGGCCA 5’
6. 引物的 5’ 端可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向克隆。
3’
3’
常用的热稳定 DNA 聚合酶
DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶 Pfx DNA聚合酶 来 源 Thermus aquaticus Thermococcus sp. KOD PCR产物 末端 3’A 平端 3’ 5’ 外切酶 活性 (校正) 无 有
Pfu DNA 聚合酶
Pwo DNA 聚合酶 Vent DNA 聚合酶 Deep Vent DNA 聚合酶 UITma DNA 聚合酶 Tth DNA 聚合酶
Pyrococcu furiosus
Pyrococcu woesei Thermococcus litoralis Pyrococcu sp. GB-D Thermotoga maritima Thermus thermophilus
1. 转移方法 • 毛细管转移 (Capillary transfer) 在缓冲液中，DNA 或 RNA 从凝胶中被动地转移到膜上。
•
•
真空转移 (Vacuum blotting)
电转移 (Electroblotting) 电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。
2. 膜支持物 • • 尼龙膜 (Nylon membrane) 硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose membrane)
1. 探针 杂交前用热变性方法将双链 DNA 探针变性为单链 DNA 探针。 2. 杂交条件 保证探针与靶分子特异杂交。 3. 洗膜 使探针与非特异杂交的序列分离。
探针与靶分子的杂交
六、DIG 探针的检测
1. 在抗 DIG 抗体上偶联荧光素 用于原位杂交
2. 在抗 DIG 抗体上偶联碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催 化的底物显色反应或化学发光反应检测 DIG 探针信 号。 • 用于显色反应的底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) • 用于化学发光反应的底物 CSPD 和 CDP-Star
毛细管转移
四、将 DNA/RNA 固定在膜上的方法
1. 干烤 置尼龙膜于抽真空的 120C 烤箱中 2 小时； 置硝酸纤维素膜于抽真空的 80C 烤箱中 2 小时。 2. UV 交联作用 用 UV 将 DNA/RNA 固定在尼龙膜上。
UV 交联仪 (UV Crosslinker)
五、DIG 探针与靶分子的杂交
Hybridization Oven
Array Scanner
正常细胞
mRNA cDNA
(红色荧光染料标记的 cDNA)
异常细胞
mRNA cDNA
(绿色荧光染料标记的 cDNA)
与芯片杂交
只在正常细胞中表达的基因 只在异常细胞中表达的基因 在正常细胞在异常细胞中等 量表达的基因 在正常细胞中高表达的基因 在异常细胞中高表达的基因 在正常细胞在异常细胞中都 不表达的基因
引物设计的原则
1. 长度： 18 - 24 个核苷酸； 2. G＋C ％ ：40 - 60％； 引物长度为 18 - 24 个碱基： Tm (C) ＝ 4 (G＋C) ＋ 2 (A＋T) 5’ ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3’ G＋C ＝ 12；A＋T ＝ 8 Tm ＝ 4 X 12 ＋ 2 X 8 ＝ 64C 3. 四种碱基随机分布；
4. 引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；
5’ GTTGACTTGATATTCTCAAG 3’ 引物的自身互补序列形成发夹结构 5’ GTTGACTTGATA T 3’ GAACTCT
5. 引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体 (dimer)；
5’ ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3’
二、DNA/RNA 样品的制备及电泳
1. • • • DNA 样品 制备基因组 DNA; 限制性内切酶酶切基因组 DNA; 用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组 DNA
2. RNA 样品 • 制备总 RNA; • 用变性琼脂糖凝胶电泳分离 RNA
三、DNA/RNA 从凝胶向膜的转移 - 印迹 (blotting)
聚合酶链式反应
(Polymerase Chain Reaction)
PCR 原理
PCR 是利用热稳定 DNA 聚合酶在体外快速 扩增 (复制) 某一特定 DNA 片段的方法。
Kary B. Mullis
1983 发明 PCR 技术; 1993 获得诺贝尔化学奖
美国 Yellowstone 公园的 热泉
DNA 序列测定 (DNA sequencing)
2’, 3’-ddNTP
DNA 测序方法
双脱氧链终止法 (Sanger 法): 在 DNA 聚合酶的催化下， 2’, 3’-ddNTP 底物通过其 5’ -P 基团掺入到延伸的 DNA 链中；由于缺少 3’ -OH，后续 dNTP 不能与其形成磷酸 二酯键，导致 DNA 链的合成终止。
缺口平移法
每 25-36 个核苷酸 1 个
PCR 法 cDNA 探针 寡核苷酸探针 逆转录法 3’末端标记 3’末端加尾标记 5’末端标记 RNA 探针 体外转录法
每 25 个核苷酸 1 个 每 25-36 个核苷酸 1 个 3’末端只有一个 每 12 个核苷酸 1 个 5’末端只有一个 每 25-36 个核苷酸 1 个
平端
平端 平端 平端 平端 3’A
有
有 有 有 有 无
PCR 反应条件的设定
待扩增片段：1000 bp 引物 Tm ＝ 55℃ DNA 模板变性: 94℃, 5分钟;
PCR 循环 (30 次):
94℃, 30秒; 50℃, 30秒; 72℃, 1分钟;
72℃, 7-10分钟
最终延伸:
PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳
PCR 产物
PCR 产物
RT-PCR
逆转录酶以 mRNA 为模板合成第 1 条 cDNA 链，然后通过 PCR 反 应扩增出许多 cDNA 分子拷贝。用于 检测某一基因在转录水平的表达 及克隆特异的 cDNA
下游引物 • 特异性引物 • Oligo(dT)
一步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在 同一个试管中进行。 两步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在 不同的试管中进行。
PCR 技术的应用
1. 基础研究 (1) 基因克隆：从核酸数据库中获得特定基因的核苷酸序列，设计引物。 (2) cDNA 克隆：从核酸数据库中获得特定 cDNA (mRNA) 的核苷酸序列， 设计引物。 (3) 基因定向突变 (Site-specific mutagenesis )：引物含有突变的碱基。 (4) 基因表达：用 RT-PCR 或 qRT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表 达。 2. 医学 (1) 感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。 (2) 遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。 (3) 恶性肿瘤的诊断