自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南
mcherry-gfp-lc3原理
mcherry-gfp-lc3原理
Mcherry-GFP-LC3是一种荧光标记蛋白，用于研究细胞自噬。
原理如下：
1. Mcherry是一种红色荧光蛋白，GFP是一种绿色荧光蛋白，它们都可以通过荧光显微镜观察。
2. LC3是一种微管相关蛋白3（Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3），参与调控和介导细胞自噬过程。
LC3有LC3-I和LC3-II两种形式，LC3-I是胞浆中的非结合形式，LC3-II是结合在自噬小体（autophagosome）膜上的形式。
3. Mcherry-GFP-LC3是将Mcherry和GFP两种荧光蛋白与
LC3一起融合而成。
在正常条件下，细胞中的自噬活性较低，Mcherry-GFP-LC3主要存在于胞浆中。
4. 当细胞启动自噬过程时，LC3-I会转化为LC3-II，并结合在自噬小体膜上。
由于GFP对酸性条件敏感，在自噬小体酸性环境中会逐渐失去荧光，而Mcherry对酸性环境不敏感，能够保持红色荧光。
5. 通过观察Mcherry-GFP-LC3的荧光表达，可以判断细胞是否在进行自噬。
当细胞开始自噬时，会出现红色和黄色（红色与绿色复合）荧光，而在胞浆中继续存在的Mcherry-GFP-LC3会呈现黄色荧光，表明自噬的早期过程。
当自噬小体与溶酶体融合后，酸性环境导致GFP的荧光丧失，只保留红色荧光，表明自噬已经发生。
综上所述，通过观察Mcherry-GFP-LC3的荧光表达变化，可以定量分析细胞中自噬的活性和过程。
汉恒-自噬及其研究方法第三版
自噬（Autophagy）及其研究方法概述汉恒Th物技术服务手册目录1概念2自噬的过程3自噬的特性4自噬过程的调控5自噬与肿瘤的关系6自噬的研究方法概述7汉恒自噬研究特色服务自噬研究相关产品及服务1.病毒工具（独家推出）mRFP-GFP-LC3腺病毒系统，可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发Th过程（具体内容后面有介绍）；2.自噬相关服务汉恒Th物可提供自噬研究整体科研服务，若您的时间紧张或是对实验有所顾忌，我们可以为您代劳部分实验内容；3.自噬研究相关试剂汉恒Th物可以根据您的实验需求为您提供最实用的试剂产品，让你用的放心，省心！产品厂商规格A14292,Premo自噬TB/GFP TR-FRETinvitrogen6000Tests LC3B抗体试剂盒pllabs0.1mgAnti-MAP1A/LC3A/B自噬微管相关蛋白轻链3抗体pllabs0.1mgAnti-MAP1LC3A(microtubule-associated protein1light chain3)自噬微管相关蛋白轻链3抗体Invitrogen1mg/1ml兔抗人、大、小APG4B细胞自噬相关抗体\Anti-APG4B/AUTL1BD1mg/1ml自噬微管相关蛋白轻链3抗体\Anti-MAP1LC3AAnti-SQSTM1/p62antibody abcamSigma1g溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）mTOR抑制剂rapamycin Sigma20mM自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）Sigma100mg1概念目前根据发Th过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy（CM A）大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
mrfp-gfp-lc3自噬评判标准
mrfp-gfp-lc3自噬评判标准摘要：1.自噬概述2.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的含义3.自噬在生物体中的功能4.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的应用领域5.我国在mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准研究方面的进展6.未来发展趋势与挑战正文：1.自噬概述自噬是细胞内一种重要的降解机制，通过吞噬并降解细胞内有害蛋白质、细胞器以及其他有害物质，维持细胞内稳态。
自噬过程分为四个阶段：招募、吞噬、融合和降解。
近年来，自噬在生物学和医学研究中受到广泛关注，与许多疾病的发生和发展密切相关。
2.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的含义mrfp-gfp-lc3 是一种用于检测自噬过程的荧光报告系统，由mRFP-GFP 融合蛋白和LC3 蛋白组成。
mRFP-GFP 融合蛋白能够反映自噬泡的融合过程，LC3 蛋白则可以作为自噬体的标志物。
mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准是基于这一荧光报告系统，通过对细胞内mRFP 和GFP 信号的动态变化以及LC3 puncta 的形成来评估自噬的活性和效率。
3.自噬在生物体中的功能自噬在生物体中具有多种功能，包括维持细胞内稳态、降解有害蛋白质、细胞器的更新与维护、抵抗外部压力以及调控细胞生长和死亡等。
自噬异常与许多疾病的发生和发展密切相关，如神经退行性疾病、肿瘤、免疫疾病等。
4.mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准的应用领域mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准广泛应用于生物学和医学研究中，包括自噬调控机制的研究、药物筛选、疾病模型的建立以及治疗策略的开发等。
通过这一评判标准，研究人员可以快速、准确地评估自噬活性和效率，为进一步研究自噬在生物体中的作用提供便利。
5.我国在mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准研究方面的进展近年来，我国在mrfp-gfp-lc3 自噬评判标准研究方面取得了显著进展，不仅在实验技术上不断优化，而且在自噬调控机制、疾病模型以及治疗策略等方面取得了突破。
lc3双荧光自噬流原理
lc3双荧光自噬流原理LC3双荧光自噬流原理是指通过标记LC3蛋白的N端和C端分别与绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）结合，来研究细胞中的自噬过程。
自噬是一种细胞内垃圾清除机制，可以通过分解细胞内受损或老化的蛋白质、细胞器和长链脂肪酸等细胞成分，提供新的营养物质和能量。
理解自噬的调控机制和功能对于许多疾病的研究具有重要意义。
LC3（Microtubule-associated protein light chain 3）蛋白是自噬过程中的一个关键分子，它可以作为自噬小体的特异性标记物。
在自噬过程中，LC3蛋白从非修饰形式（LC3-I）转化为修饰形式（LC3-II），并参与自噬小体的形成和界定。
LC3双荧光自噬流技术就是通过标记LC3蛋白的N端和C端分别与GFP和RFP结合来追踪自噬小体的形成和变化。
LC3蛋白有两个酶解位点，分别是Glycine120和Glycine121。
在绝大多数正常生理条件下，LC3蛋白主要以非修饰形式存在于细胞质中，称为LC3-I。
LC3-I分子上的Glycine120位点和Glycine121位点上含有一个负电荷的C-末端甘氨酸。
当自噬通路被激活时，LC3-I分子的C-末端甘氨酸被肌酸激酶ATG4剪切，形成一个临时的中间体LC3-I-PE （LC3-半胱氨酸乙酰乙酸胺酰酶）。
LC3-I-PE分子会进一步和自噬小体膜结合，形成LC3-II分子。
LC3-II通过与自噬小体膜相互作用，将自噬小体界定在特定的细胞区域，并参与自噬小体的形成和降解进程。
LC3-II分子富集在自噬小体内，是自噬小体的特异性标记。
因此，观察LC3-II的表达水平和荧光变化，可以反映自噬小体的形成和变化。
LC3双荧光自噬流技术就是通过将LC3-GFP和LC3-RFP融合蛋白导入细胞中，使它们定位在细胞质，并随后转变为LC3-II形式进入自噬小体。
在正常情况下，LC3-GFP和LC3-RFP会同时发放绿色和红色荧光。
细胞自噬检测
细胞自噬检测引言细胞自噬（Autophagy）是一种维持细胞内稳态的重要细胞生理过程。
它通过将细胞内的有害垃圾物质、受损蛋白质和细胞器通过包裹成双层膜体而将其降解和回收。
细胞自噬不仅对于维持细胞内环境的平衡，也在细胞营养不足、应激等情况下发挥至关重要的作用。
为了研究细胞自噬的机制、功能以及其在疾病中的作用，科研人员常常需要进行细胞自噬的检测。
本文将介绍一些常用的细胞自噬检测方法，旨在帮助科研人员更好地开展相关研究。
方法一：免疫组化检测免疫组化检测是常用的细胞自噬检测方法之一，它利用特异性抗体识别和定位自噬相关的蛋白质标记。
以下是免疫组化检测的步骤：1.固定和透化：将细胞样品固定在载玻片上，并通过透化剂处理，以便抗体能够穿透细胞膜进入细胞内。
2.抗体反应：加入特异性的抗体，使其与目标自噬蛋白结合。
3.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的抗体。
4.二抗结合：加入与第一抗体来源不同种类的第二抗体，它能连接到第一抗体上，使得目标蛋白能够被可见光或荧光染料标记。
5.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的第二抗体。
6.显色或荧光检测：加入适当的显色剂或荧光标记物，观察细胞自噬标记的结果。
免疫组化检测方法适用于观察细胞内特定蛋白质的表达和定位情况，从而间接地了解细胞自噬的活性。
方法二：转染自噬标记基因为了直接观察细胞内自噬相关的蛋白质的表达情况，科研人员可以利用转染自噬标记基因的方法。
以下是一种常用的自噬标记基因：mRFP-GFP-LC3。
mRFP-GFP-LC3是一种融合蛋白，其中GFP（绿色荧光蛋白）和mRFP（红色荧光蛋白）与自噬相关的蛋白LC3融合在一起。
GFP能够在细胞自噬过程中被降解，而mRFP则能够在自噬过程中保持稳定。
转染mRFP-GFP-LC3基因后，科研人员可以通过观察细胞中的荧光信号来确定细胞的自噬活性。
当细胞自噬活性较低时，绿色和红色荧光都很强；而当细胞自噬活性增加时，绿色荧光减弱而红色荧光增强。
自噬研究方法及研究步骤
自噬研究方法及研究步骤自噬简介细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。
比利时科学家Christian de Duve在上世纪50年代经过电镜察看到自噬体（autophagosome）构造，并且在 1963 年溶酶体国际会议上首先提出了“自噬”这种说法。
因而Christian de Duve被公以为自噬研讨的鼻祖。
Christian de Duve 也因发现溶酶体，于1974年取得诺贝尔奖。
目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。
●大自噬（Macroautophagy）：即我们说的自噬（autophagy）;●微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;●分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
通常说的自噬泛指Macroautophagy.自噬的过程1）：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，被称为Phagophore。
2）：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，全部揽入，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。
3）：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。
4）：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
自噬_检测指南
Autophagosome formation
Class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) complex:
PtdIns3K Vps34 (vacuolar protein sorting 34), a myristoylated serine/threonine kinase Vps15, Atg14 ; Beclin 1 ;
Vesicle fusion and autophagosome breakdown
In mammalian cells, the fusion event requires the lysosomal membrane protein LAMP-2 and the small GTPase Rab7.
Maturation，Degradation: Vesicle fusion and autophagosome breakdown
Induction
Normal conditions Basal-level autophagy is very low; Autophagy inhibitor: serine/threonine protein kinase TOR(target of rapamycin) input information from multiple upstream signal transduction pathways (discussed below) and negatively regulates another serine/threonine kinase, Atg1, in nutrient-rich conditions
自噬双标腺病毒(mrfpgfplc3)使用指南1404知识讲解
自噬双标腺病毒( mRFP-GFP-LC3 )使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating )”的现象，凋亡是“自杀( Self-killing )”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜(目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层)包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3勺剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP(-RFP) -LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技(上海)有限公司自主研发了用于实时监测自噬( 流)的mRFP-GFP-LC腺病毒，mRFP用于标记及追踪LC3, GF啲减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GF荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭, 此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3 腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80 C冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80 C冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4C保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20 C下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
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自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
（二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞用PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，并尽快用完。
感染目的细胞由于腺病毒是自主复制性基因载体，不能插入基因组稳定遗传，因此实验中细胞感染腺病毒的实验需要具体情况具体对待。
一般根据外界刺激处理的时间来选择感染腺病毒的时间，短时程处理（一周之内）建议先感染腺病毒之后再进行处理，长时程刺激的建议在刺激结束前2~3天进行腺病毒感染。
另外不同细胞的MOI不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。
（一）细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml 细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。
（二）病毒感染I、贴壁细胞由于该病毒感染后续拍照需要进行自噬小点的计算，因此需要在高倍镜下拍照，条件允许最好使用共聚焦显微镜拍照，此时需要把细胞铺被在玻片上面（部分细胞铁壁能力不是很强，此时需要预先在玻片上包被galetin甚至laminin）。
感染实验在1/2体积培养液感染（详见下表格）。
加入的病毒量范围在MOI=20～50内（具体感染的操作量参见附录表格），每个MOI值加两个孔 2小时后换液。
II、悬浮细胞上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。
若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置10min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至2小时后换液即可。
（三）观察感染情况感染24小时后，可以开始观察到GFP以及RFP表达，36-48小时可以进行细胞固定、封片（需要使用防淬灭的固定剂）、拍照分析。
（四）结果分析mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒中表达的GFP和mRFP用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体（由GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光，原理如下图所示）。
统计方法我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱:一般统计采用人为计数的方法，也就是统计叠加（overlay）之后黄色斑点和红色斑点的数目，然后做出bar图。
如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2 小时后出现明显增强的自噬以及自噬流（通过merge后的红色小点明显增多可以判定自噬流水平升高）。
Antioxid Redox Signal 14(11): 2179-2190.实验操作注意事项1、操作病毒时请尽量使用生物安全柜；2、操作时需戴上帽子，佩戴双层手套，双层口罩；3、病毒操作中绝对禁止在安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况；4、剩余的病毒和接种用的注射器等耗材需高压灭菌后才能扔弃；5、操作完毕要及时用肥皂和水洗手消毒；6、未尽事宜请咨询汉恒生物技术人员了解详情，汉恒生物全国免费热线400-092-0065；7、您可登录汉恒生物官网观看腺病毒实验操作视频，并与我们的客服人员互动交流。
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